6種牛羊病毒性病原GeXP多重PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）、綿羊痘病毒（Sheep pox virus，SPPV）、牛疙瘩皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)、傳染性膿皰病毒(Contagiousecthyma virus，CPDV)、藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus，BTV）、小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）能引起反芻動(dòng)物急性、熱性傳染

2、病，發(fā)病率高，危害嚴(yán)重。6種病毒中除傳染性膿皰病毒外，其余五種病毒均為OIE通報(bào)疫病病毒;我國(guó)農(nóng)業(yè)部將山羊痘、綿羊痘、牛疙瘩皮膚病、藍(lán)舌病、小反芻獸疫列為一類疫病，羊傳染性膿皰為三類疫病。此外，山羊痘、綿羊痘、傳染性膿皰亦是人畜共患傳染病，在危害畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，對(duì)人類健康也構(gòu)成嚴(yán)重危害。目前，國(guó)內(nèi)未見牛疙瘩皮膚病流行的報(bào)道。由于這6種疫病均以皮膚、黏膜產(chǎn)生皰疹、潰瘍?yōu)橄嗨婆R床癥狀，常呈混合感染，僅從臨床癥狀上難以診斷與

3、區(qū)分。傳統(tǒng)的診斷方法如病毒分離鑒定、血清學(xué)方法有操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度低、假陽(yáng)性率高等不足，難以同時(shí)對(duì)多種病原進(jìn)行檢測(cè)。因此，應(yīng)臨床和口岸快速通關(guān)檢測(cè)需要，急需建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定性好，且能同時(shí)鑒別診斷上述6種疫病病原的檢測(cè)方法。
　　GeXP-PCR(Gene eXpress Profiler-polymerase chain reaction)是將通用引物與特異性嵌合引物按比例混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由GeXP系統(tǒng)對(duì)

4、經(jīng)染色標(biāo)記處理的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段長(zhǎng)度的測(cè)定的一種新技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)。近年來GeXP系統(tǒng)常用于基因表達(dá)分析、病毒檢測(cè)等領(lǐng)域的研究與運(yùn)用。
　　本研究以山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛疙瘩皮膚病毒、傳染性膿皰病毒、藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒為對(duì)象，優(yōu)化建立GeXP多重PCR檢測(cè)方法。該方法能同時(shí)對(duì)上述6種牛羊病毒性病原進(jìn)行鑒別檢測(cè)，為山羊痘等6種疫病的鑒別診斷、疫情監(jiān)控、流行病學(xué)調(diào)查、出入境動(dòng)物檢疫等提供技術(shù)保障，

5、對(duì)保障我國(guó)的畜牧業(yè)生產(chǎn)安全、人類健康具有十分重要的意義。
　　主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛疙瘩皮膚病毒、傳染性膿皰病毒、藍(lán)舌病病毒和小反芻獸疫病毒的保守序列設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增、目的片段的克隆及測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank中各毒株的同源性都在97％以上，表明設(shè)計(jì)的6對(duì)特異性引物均能擴(kuò)增出目標(biāo)序列。
　　(2)通過對(duì)特異性嵌合引物的引物濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，

6、分別建立6種牛羊病毒性病原的GeXP單重PCR體系，進(jìn)行單重GeXP-PCR的靈敏度試驗(yàn)，并與OIE推薦方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，牛疙瘩皮膚病病毒、傳染性膿皰病毒的靈敏度為103 copies/μL;山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、綿羊痘病毒和藍(lán)舌病病毒的靈敏度可達(dá)到102 copies/μL?？梢姡珿eXP單重PCR檢測(cè)方法具有較高的靈敏度，比OIE推薦方法的靈敏度(106～107 copies/μL)高10000～100000倍。

7、　　(3)建立并優(yōu)化6種牛羊病毒性病原GeXP多重PCR檢測(cè)體系，并進(jìn)行特異性、靈敏度試驗(yàn)。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，牛疙瘩皮膚病病毒、傳染性膿皰病毒、山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、綿羊痘病毒和藍(lán)舌病病毒均產(chǎn)生了清晰且與預(yù)期目標(biāo)片段大小相符的特異性擴(kuò)增峰，呈陽(yáng)性;其余的毒株均無(wú)非特異性擴(kuò)增，呈陰性，說明本研究所建立的方法特異性良好。靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)6種病原單管擴(kuò)增均能同時(shí)檢測(cè)到的靈敏度達(dá)104 copies/μL。
　　(4)用本

8、研究建立的GeXP多重PCR檢測(cè)方法和OIE推薦的方法對(duì)模擬臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。在制備的54份模擬樣品中，GeXP多重PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性率為94.87％，假陽(yáng)性率為6.67％，假陰性率為5.13％。在35份單獨(dú)感染的模擬樣本（除CPDV）及陰性樣本中，GeXP多重PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性率為95％，假陽(yáng)性率為6.67％％，假陰性率為5％; OIE推薦方法檢測(cè)的陽(yáng)性率為70％，假陽(yáng)性率為0％，假陰性為30％。結(jié)果表明，GeXP多重PCR檢測(cè)方