激活NF-κB信號通路的高致病性PRRSV非結構蛋白的篩選及其作用機制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙、仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的一種新發(fā)性病毒傳染病。PRRSV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，可編碼14種非結構蛋白和7種結構蛋白，其中Nsp2是分子量最大且最易發(fā)生變異的一個病毒編碼蛋白。
　　 2006年，由PRRSV變異株引起的高致病性PRRS在我國大規(guī)模暴發(fā)，造成上百萬頭豬死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。與

2、傳統的PRRSV毒株相比，高致病性PRRSV毒株能夠引起更強烈的炎癥反應和更高的死亡率，并成為我國流行和蔓延的主要毒株。然而，目前對這種毒株感染后引起宿主細胞的信號轉導機制知之甚少。針對這種新的PRRSV，本文開展了對其誘導機體產生炎癥反應的信號轉導機制研究，為闡明PRRSV的致病機理提供理論依據。具體研究內容包括：
　　 1.高致病性PRRSV感染激活NF-κB信號通路的研究
　　 NF-κB是一類具有多重轉錄調節(jié)作用

3、的核蛋白因子，在炎癥反應、免疫反應和細胞的增殖中都有著重要的作用。利用NF-κB熒光素酶報告系統檢測高致病性PRRSV對NF-κB的激活情況，發(fā)現其能顯著激活NF-κB并依賴于病毒的復制，且呈劑量依賴性。進一步以PRRSV感染MARC-145細胞，檢測細胞內TLR信號通路的關鍵接頭蛋白及重要信號分子的表達情況，對PRRSV激活NF-κB的分子機制進行了初步探究。結果表明，PRRSV能上調病原模式識別受體TLR2和TLR4以及信號分子TR

4、AF6和TAK1的表達，推測PRRSV通過同時上調模式受體TLR2和TLR4進而上調信號分子TRAF6和TAK1的表達從而激活NF-κB信號通路；同時還發(fā)現PRRSV感染的MARC-145細胞內TLR3和其他的信號蛋白并無顯著上調，甚至部分細胞因子在某些時間點還出現表達下調的趨勢。這提示著PRRSV在感染細胞內調控信號傳導途徑的復雜性，其可能是通過多種調控策略調控NF-κB的上游信號通路，而最終導致NF-κB活化的。這些結果為解釋臨床上

5、PRRSV引起復雜的機體免疫反應和強烈的炎癥反應補充了有用的數據。
　　 2.激活NF-κB信號通路的高致病性PRRSV非結構蛋白的篩選
　　 已有研究表明，PRRSV編碼的所有結構蛋白中，N蛋白能顯著激活NF-κB。為了闡明PRRSV編碼的非結構蛋白在其誘導NF-κB活化中的作用，利用NF-κB熒光素酶報告系統，對高致病性PRRSV所有非結構蛋白激活NF-κB的能力進行研究，發(fā)現只有Nsp2能顯著激活NF-κB，而其他

6、的非結構蛋白對NF-κB無明顯激活。
　　 3.高致病性PRRSV Nsp2激活NF-κB信號通路的分子機制研究
　　 為了解析Nsp2激活NF-κB的分子機制，首先以Nsp2的真核表達質粒轉染細胞，檢測IκBβ和NF-κB下游炎癥細胞因子的表達及NF-κB p65的磷酸化和轉定位情況，發(fā)現Nsp2能誘導IκBα的降解及p65的磷酸化和轉核，并激活NF-κB下游炎癥細胞因子。進一步利用Nsp2截短突變體的真核表達質粒，證

7、實Nsp2激活NF-κB的作用域位于高變區(qū)的180-480位氨基酸之間。通過對Nsp2跨膜結構域的預測和跨膜區(qū)缺失突變體的熒光素酶實驗，發(fā)現其C端的跨膜結構在其細胞定位以及激活NF-κB中均發(fā)揮重要作用，推測其線粒體定位可能為其激活NF-κB所必需。進一步利用RNA干擾實驗和Nsp2超表達對Nsp2誘導NF-κB的上游信號通路進行了探究，結果表明，接頭蛋白TLR4和信號分子TRIF、MAVS的沉默可以抑制Nsp2對NF-κB的激活；而N

8、sp2的超表達可以上調TLR4、TRIF以及TRAF2的表達。這些結果表明，PRRSV Nsp2可能是同時通過TLR4和RIG-1依賴的信號途徑激活NF-κB。由于RIG-1信號通路中的重要接頭蛋白MAVS是一個線粒體定位蛋白，而Nsp2的線粒體定位模式改變后其激活NF-κB的能力顯著降低，這說明Nsp2與MAVS的共定位對Nsp2激活NF-κB具有重要的作用。
　　 4.Nsp2與宿主蛋白RAI相互作用激活NF-κB的研究

9、r>　　 由于病毒感染動物機體后與宿主的相互作用是其致病的分子基礎，本研究又從蛋白相互作用的角度對Nsp2激活NF-κB的可能機制進行探究。首先運用酵母雙雜交技術從豬腦cDNA文庫中篩選了與PRRSV Nsp2相互作用的宿主蛋白，并選取能與p65結合從而特異性抑制NF-κB轉錄活性的宿主蛋白RAI作為深入研究的對象。進一步，通過哺乳動物雙雜交系統、免疫共沉淀技術、熒光共定位等實驗證實了Nsp2與RAI在哺乳動物細胞內的相互作用。并利用

10、截短突變體和酵母回返實驗，確定了二者相互作用的功能域分別位于Nsp2中間的高變區(qū)和RAI的C端，由于RAI與p65的互作區(qū)域同樣位于C端，推測當PRRSV感染細胞后，其編碼的Nsp2可能通過與RAI相互作用從而拮抗RAI對NF-κB的抑制作用，為了驗證這一推測，利用NF-κB啟動子的熒光素酶報告系統檢測了Nsp2與RAI相互作用對NF-κB表達的影響，結果超表達RAI顯著抑制NF-κB的啟動子活性，而同時超表達Nsp2與RAI時不影響N

11、F-κB的啟動子活性；進一步檢測Nsp2對RAI表達水平的影響，發(fā)現Nsp2對RAI的表達水平無明顯影響，這表明Nsp2拮抗RAI的NF-κB抑制功能并不是通過降低其表達水平來完成的，這也進一步證實Nsp2可能是通過拮抗RAI與p65的相互作用從而激活NF-κB的。
　　 5.PRRSV經典株與變異株引起不同程度炎癥反應的分子機理研究
　　 通過比較PRRSV經典毒株CH-1a與變異毒株WUH3的Nsp2激活NF-κB的

12、能力，發(fā)現WUH3株的Nsp2激活NF-κB的能力顯著高于CH-1a株的Nsp2。由于變異毒株與經典毒株Nsp2的主要差異是中間高變區(qū)內存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失，為了探究30個氨基酸的缺失是否是造成二者激活NF-κB能力差異顯著的原因，構建了一系列Nsp2的插入和缺失突變體，并通過熒光素酶報告系統檢測其激活NF-κB的能力。結果顯示，1個或29個氨基酸的缺失并不是造成二者激活NF-κB能力差異的直接原因。進一步，通過熒光素酶報告系統

13、對兩種毒株的Nsp2及其突變體激活IL-6、IL-8、RANTES等炎癥細胞因子的能力進行了比較，發(fā)現兩種毒株的Nsp2激活IL-6、IL-8、RANTES的能力均存在顯著差異，變異株的Nsp2的激活能力顯著高于經典株的Nsp2，而1個或29個氨基酸的缺失并不是造成此種差異的直接原因。由于核轉錄因子NF-κB與炎性細胞因子IL-6、IL-8、RANTES都是參與機體炎癥反應的重要細胞因子，因此以上結果為解釋臨床上不同毒株引起不同程度的炎