玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因B695的功能分析.pdf

1、bHLH類轉(zhuǎn)錄因子作為一類含有螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix，HLH)結(jié)構(gòu)域且富含堿性氨基酸的調(diào)控蛋白質(zhì)，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育及對(duì)干旱、高鹽、重金屬等脅迫中起重要作用。而金屬錳作為植物體生長(zhǎng)必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，參與植物體的各種代謝反應(yīng)；但是錳毒是酸性土壤中限制作物產(chǎn)量的重要因子，Mn的大量積累會(huì)對(duì)植物體造成嚴(yán)重的毒害。了解植物體bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)改良作物抗逆性有重要意義。
　　 本論文對(duì)玉米中一個(gè)編

2、碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因B695進(jìn)行了較為深入的功能分析，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.從玉米中克隆了一個(gè)編碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因B695。該基因全長(zhǎng)cDNA序列749 bp，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)?49 bp，HLH保守域位于第92-143個(gè)氨基酸之間。
　　 2.構(gòu)建pEGAD-B695植物GFP穩(wěn)定表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示B695具核定位信號(hào)，定位于洋蔥的細(xì)胞核中。
　　 3.構(gòu)

3、建pET-30a-B695原核表達(dá)載體，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出在C端帶有6×His標(biāo)簽的融合蛋白，B695融合蛋白大小約為32kDa；同時(shí)制備了B695多克隆抗體，經(jīng)Western Blot檢測(cè)表明多克隆抗體與目的蛋白識(shí)別良好。
　　 4.利用酵母單雜交的方法驗(yàn)證了B695在酵母中能夠激活報(bào)告基因的表達(dá)，具有轉(zhuǎn)錄激活功能，而且具有該功能的結(jié)構(gòu)域位于C端，其N端則不具備轉(zhuǎn)錄激活功能。
　　 5.通過(guò)Real-time PC

4、R的方法，分析不同重金屬脅迫處理下B695在玉米中的內(nèi)源表達(dá)情況。結(jié)果顯示：Fe、Mn、Cu、Zn都可誘導(dǎo)B695的表達(dá)；Mn可以激發(fā)玉米中內(nèi)源B695基因的表達(dá)。
　　 6.通過(guò)對(duì)酵母轉(zhuǎn)基因菌株的脅迫處理發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)B695基因的酵母能夠顯著提高AH109酵母菌株對(duì)逆境脅迫(高鹽，干旱，重金屬)的適應(yīng)能力，尤其是對(duì)金屬M(fèi)n，當(dāng)Mn2+外界濃度高達(dá)正常濃度的200倍時(shí)，轉(zhuǎn)B695基因的酵母仍能正常生長(zhǎng)；同時(shí)通過(guò)各種脅迫處理的1/2

5、MS平板上對(duì)B695過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因系和野生型煙草植株種子萌發(fā)率、表型觀察和形態(tài)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)，證明B695提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)Mn的耐受性。
　　 7.對(duì)Mn脅迫處理后的B695轉(zhuǎn)基因煙草過(guò)表達(dá)系＃6、＃7、＃8，和野生型對(duì)照組煙草植株進(jìn)行NBT和DAB染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)B695基因過(guò)表達(dá)系植株體內(nèi)的活性氧(超氧陰離子，過(guò)氧化氫)水平明顯低于野生型，B695過(guò)表達(dá)系煙草的生長(zhǎng)狀況也要優(yōu)于野生型對(duì)照組；活性氧清除相關(guān)酶的酶活測(cè)定及Real-tim

6、e PCR結(jié)果顯示B695過(guò)表達(dá)系煙草在錳處理后，體內(nèi)的活性氧清除相關(guān)酶活性及其編碼基因表達(dá)水平明顯高于野生型對(duì)照組，說(shuō)明B695能減少植物體內(nèi)ROS的積累。
　　 8.通過(guò)Real-time PCR分析，在正常條件和Mn處理?xiàng)l件下，抗逆相關(guān)基因NtCDPK2、NtAREB、NtERF在B695轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量均低于野生型，NtLEA5表達(dá)量相差不大，跨膜運(yùn)輸相關(guān)基因Nramp、Irt1表達(dá)量低于野生型。證明由于B695的作

7、剛，使得過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草在Mn脅迫處理后在調(diào)控水平上引起了某些相關(guān)基因的表達(dá)量的改變，從而導(dǎo)致在表型上表現(xiàn)出對(duì)錳脅迫抵抗能力提升的現(xiàn)象
　　 9.通過(guò)測(cè)定Mn處理后B695轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草體內(nèi)的鐵與錳含量，發(fā)現(xiàn)B695轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)的含鐵量高于野生型對(duì)照組，錳含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型對(duì)照組，驗(yàn)證了IRT1和Nramp可以在缺鐵環(huán)境下能夠提高植物中吸收錳的能力；并且由于B695的作用，可以減少植株對(duì)Mn的過(guò)量吸收，使植物體內(nèi)Mn

8、含量保持在一個(gè)不影響植物正常生命活動(dòng)的濃度。
　　 10.短時(shí)間的Mn脅迫處理野生型對(duì)照組與B695轉(zhuǎn)基因煙草后的活性氧染色結(jié)果說(shuō)明，該轉(zhuǎn)錄基因?qū)儆谡T導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)外界提供Mn信號(hào)時(shí)，B695開(kāi)始發(fā)揮作用，在短時(shí)期內(nèi)使植物體內(nèi)的活性氧積累恢復(fù)到正常水平。
　　 由上述結(jié)果初步推測(cè)，B695可能作為一類調(diào)控蛋白，參與Mn相關(guān)的逆境信號(hào)通路，與植物體內(nèi)Mn的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)，并對(duì)ROS水平起重要調(diào)節(jié)作用。本研究試圖弄清非生物逆