牛誘導多能干細胞的研究.pdf

1、體細胞誘導為多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技術的出現(xiàn)引起了全球廣泛的關注，其在體細胞重編程機理和再生醫(yī)學應用等方面的研究中具有不可比擬的價值和優(yōu)越性，并且避免了因使用胚胎干細胞而涉及到的倫理問題。牛作為大家畜中的最重要物種，為人類提供了絕大多數(shù)的肉和奶制品，對其體細胞誘導為多能干細胞原理和技術進行深入研究顯得尤其重要。本研究對牛誘導多能干細胞(biPSCs)的制備方法和原理、生物學

2、特性等進行系統(tǒng)的探討，以期推動其他大家畜誘導多能性的研究。
　　 1.建立了無病毒介導生產牛誘導多能干細胞的方法。
　　 研究結果顯示，本研究成功構建兩個包含不同轉錄因子順序的質粒載體pOSKM和pKMOS，并使用脂質體法和電穿孔法介導質粒轉染兩種方法將所構建質粒載體成功轉染牛成纖維細胞，細胞質粒轉染12天后檢測到4轉錄因子內源性表達；2i/LIF培養(yǎng)液對成纖維細胞早期重編程有重要作用，PD有效的抑制牛成纖維細胞MEK1

3、/2信號通路，CHIR顯著增加牛成纖維細胞的堿性磷酸酶(AP)活性；兩種方法轉染后細胞在2i/LIF培養(yǎng)液中培養(yǎng)均可形成類iPS克隆。
　　 2.優(yōu)化和完善了牛多能干細胞誘導和培養(yǎng)體系。
　　 研究結果顯示，兩個不同轉錄因子順序的質粒(pOSKM和pKMOS)對biPSCs的生產沒有顯著影響；脂質體轉染法無論從單細胞Sox2陽性率還是從類iPS克隆形成率都顯著高于電轉染法(15.8% vs2.1%；63.7 vs23.4

4、，p<0.05)；胚胎和胎兒來源的細胞其轉染效率顯著高于成體細胞，而轉基因的胎兒細胞與成體細胞在轉染效率方面無顯著差異。在類iPS克隆形成率方面，胎兒成纖維細胞系BFF64(♂)顯著低于胚胎成纖維細胞系，但顯著高于其他所有細胞系，成年體細胞系與轉基因胎兒細胞系差異不顯著，胎兒成纖維細胞系最優(yōu)；玻璃材質上培養(yǎng)的轉染后細胞無論是克隆形成時間和AP陽性克隆形成率都顯著優(yōu)于塑料材質，8孔培養(yǎng)玻片出現(xiàn)克隆的時間最早，10 mm細胞爬片形成AP陽性

5、克隆數(shù)量最多；轉染細胞培養(yǎng)于飼養(yǎng)層或層粘連蛋白處理的培養(yǎng)皿中，AP陽性克隆形成率顯著高于其他組，而二者之間無顯著差別；低氧培養(yǎng)體系(5%O2)培養(yǎng)轉染后細胞，與正常20%O2培養(yǎng)體系比較，發(fā)現(xiàn)對biPSCs的生產沒有顯著影響。
　　 3.初步弄清了牛誘導多能干細胞的生物學特性。
　　 研究結果發(fā)現(xiàn)，biPSCs集落性生長形成克隆，克隆隆起呈島狀，細胞亮度高，邊緣整齊光滑折光性強，細胞排列致密，無明顯細胞間隔，與牛類胚胎干

6、細胞克隆、小鼠ES/iPS克隆相似且為AP染色陽性；RT-PCR結果表明biPSCs表達多能性標志基因OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、CDH1、NANOG、DPPA3、SALLA、SOCS3和ZFP42，且表達STAT3，但不表達外胚層干細胞特異性基因T-BRACHYURY、FGF5和LEFTY2；免疫組化染色結果顯示biPSCs表達表面抗原TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3和SSEA-4，但不表達SSEA-1，

7、并表達SOX2和OCT4蛋白；biPSCs具有端粒酶活性和正常染色體核型(60條)；biPSCs體外延時培養(yǎng)可以自發(fā)分化成類上皮細胞、類神經細胞和類脂肪細胞等多種類型的細胞，體外懸浮培養(yǎng)可形成擬胚體，并能在體內分化形成畸胎瘤。
　　 4.對牛誘導多能干細胞外源轉錄因子的表達模式及增值與凋亡性能進行了研究。
　　 研究結果發(fā)現(xiàn)，轉染后初期細胞重編程主要依靠轉錄因子外源表達來推動，18天后biPSCs多能性的維持主要依靠轉錄

8、因子的內源表達；EdU標記細胞增殖檢測結果發(fā)現(xiàn)，轉染后細胞在2i/LIF培養(yǎng)液中培養(yǎng)的過程中增殖率迅速下降，克隆形成前細胞遷移頻繁，細胞在重編程過程中的遷移對類iPS克隆形成非常重要。增殖特異性標記蛋白Ki67和標志性抗原PCNA免疫組化染色獲得了相似的結果；細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)轉染后16天牛類iPS克隆，僅有1±0.4%細胞發(fā)生凋亡，而這一階段細胞增殖率為1±0.5%，因此98±0.9%細胞處于細胞沉默狀態(tài)；類iPS克隆傳代后有較高的再貼

9、壁率，但2i/LIF培養(yǎng)液不支持傳代后牛類iPS克隆的增殖。
　　 結論：本研究構建了兩個包含不同轉錄因子順序的外源質粒，成功的使用脂質體和電穿孔法對牛成纖維細胞進行轉染，并在2i/LIF培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下成功制作biPSCs；對影響biPSCs生產效率的多個因素進行探討，其中脂質體法優(yōu)于電穿孔法、牛胚胎成纖維細胞優(yōu)于其他種類細胞、玻璃材質培養(yǎng)容器優(yōu)于塑料材質、飼養(yǎng)層和層粘連蛋白(LN)預處理優(yōu)于其他預處理；實驗所得biPSCs具