慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞技術(shù)平臺的建立.pdf

1、自1980年世界上第一只轉(zhuǎn)基因小鼠制備成功后,科學家們就開始進行轉(zhuǎn)基因雞的研究,因為轉(zhuǎn)基因雞無論在基礎(chǔ)理論研究方面還是在生物技術(shù)領(lǐng)域都具有獨特的優(yōu)勢,因此建立行之有效的轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)一直是一個研究的熱點領(lǐng)域。
　　 雖然世界上已有成功獲得轉(zhuǎn)基因雞的先例,但國內(nèi)還沒有成功獲得轉(zhuǎn)基因雞的報道。本研究擬以綠色熒光蛋白基因為報告基因應用慢病毒載體感染法開展轉(zhuǎn)基因雞制備研究,希望外源基因能夠整合到性腺中,并能夠穩(wěn)定的傳遞給下一代,以在國

2、內(nèi)率先建立起一個行之有效的轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)體系。
　　 種蛋的質(zhì)量是成功獲得轉(zhuǎn)基因雞不可忽視是的一個重要因素。為獲得優(yōu)質(zhì)的種蛋,以保證實驗的順利進行,我們對周圍幾個雞場的種蛋進行篩選。通過實驗證實,大午集團的種蛋優(yōu)于其它雞場的種蛋。
　　 對雞胚操作后再進行培養(yǎng)的方法有兩種,為開窗術(shù)和代用蛋殼法。在本研究中采用開窗術(shù)進行雞胚的培養(yǎng)。在對剛產(chǎn)出的種蛋進行消毒處理后,室溫條件下水平放置過夜,使胚胎漂浮到最上端。用70％酒精擦

3、拭后,用電磨在赤道面上鋸一5mmx5mm見方的口后就可以看到胚胎,然后向其中加一定量的稀蛋清,最后用石蠟和封口膜封口。采用變溫孵化。孵化結(jié)果顯示石蠟封口的孵化率高于封口膜封口。
　　 為研究顯微注射所造成的機械損傷對孵化率的影響。我們開展了向雞胚胚下腔注射DMEM液體培養(yǎng)基實驗。對新鮮種蛋消毒和開口處理后,利用顯微注射的方法向胚下腔中注射2～2.5uLDMEM液體培養(yǎng)基。共成功注射25枚種蛋,最后有9只雛雞出殼,其孵化率為36％

4、。結(jié)果顯示我們的注射方法滿足后續(xù)實驗的進行。
　　 本研究中制備轉(zhuǎn)基因雞的方法為慢病毒載體法。慢病毒載體法是制備轉(zhuǎn)基因雞方法中最為成熟的一種方法。所使用的慢病毒載體為三質(zhì)粒系統(tǒng),即由穿梭質(zhì)粒,包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒構(gòu)成。在穿梭質(zhì)粒中用增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)作為報告基因。采用逐級稀釋法和感染293FT細胞實驗進行病毒滴度的測定。其結(jié)果顯示病毒滴度為1×109感染單位／mL(TU／mL)。
　　 在進行轉(zhuǎn)基因雞制備實

5、驗中,我們向雞胚胚下腔內(nèi)注射2～2.5uL攜帶增強型綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體懸液,其滴度為1×109U／mL,對其封口后進行孵化。共成功注射110枚種蛋,最后得到了32只原代雞。在雞30日齡時,我們從雞翅靜脈采血,利用酚氯仿抽提方法提取雞血基因組DNA,通過基因組DNA PCR方法擴增EGFP和部分載體序列。其中有4只擴增出同預期大小一致目的片段。更為有意義的是,在所養(yǎng)的16只公雞性成熟后,采其精液再利用酚氯仿抽提方法提取精液的基因