棉花(Gossypium hirsutum)WRKY基因分離與鑒定.pdf

1、棉花(Gossypium hirsutum)是世界性的重要經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。棉纖維作為重要的天然纖維，是紡織工業(yè)的主要原材料，廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、生物燃料和化學(xué)工業(yè)，棉纖維品質(zhì)決定了其作為商品的價(jià)值。然而，棉花經(jīng)常受到諸如蟲害等生物脅迫以及高鹽、干旱、低溫、營(yíng)養(yǎng)缺乏等非生物脅迫，造成棉花產(chǎn)量急劇下降。因此，通過(guò)基因工程手段將一些具有抗逆功能的基因?qū)氲街参锘蚪M中獲得抗逆新品種，將擴(kuò)大植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，降低逆境

2、對(duì)作物的影響。
　　WRKY蛋白家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，因其含有60個(gè)氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名。該類蛋白在N端含有保守的氨基酸基序WRKYGQK，在C端含有一個(gè)新型的C2H2或C2HC鋅指基序。已有研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物許多生理過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用，這些生理過(guò)程包括植物衰老、生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫（高溫、高鹽、干旱等）應(yīng)答等。另外，植物某些器官的發(fā)育以及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝，也受到WRKY蛋白的調(diào)控。但對(duì)于W

3、RKY轉(zhuǎn)錄因子是否參與調(diào)控棉纖維發(fā)育，目前尚無(wú)報(bào)道。因此，研究闡明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在棉花防御應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)理，以及WRKY轉(zhuǎn)錄因子在棉纖維發(fā)育中的作用，將是今后的一個(gè)重要研究方向。同時(shí)，上述研究對(duì)于培育抗逆作物品種也具有重要的實(shí)踐意義。
　　我們首先對(duì)棉花cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取的4000多個(gè)cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，篩選獲得4個(gè)WRKY基因（GhWRKY31-34），定量RT-PCR分析結(jié)果表明，這4個(gè)WRKY基因均在棉花根和葉片中優(yōu)

4、勢(shì)表達(dá)。為獲得在棉纖維發(fā)育中特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)的WRKY基因，我們通過(guò)電子克隆的方法得到22個(gè)WRKY基因。定量RT-PCR分析結(jié)果表明，其中有2個(gè)基因(GhWRKY12/16)在棉纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。本文主要從基因結(jié)構(gòu)特征分類和表達(dá)模式，以及蛋白結(jié)構(gòu)特征、轉(zhuǎn)錄自激活活性和亞細(xì)胞定位等方面淺析GhWRKY基因的特性及功能表達(dá)調(diào)控等，此外也對(duì)它們?cè)谝恍┓巧锩{迫應(yīng)答中的作用進(jìn)行了初步研究。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、26個(gè)GhWRKY基因

5、分離鑒定及其編碼蛋白的序列結(jié)構(gòu)特征
　　我們首先對(duì)棉花cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取的4000多個(gè)cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，篩選獲得4個(gè)全長(zhǎng)序列的WRKY基因(cDNA)，命名為GhWRKY31，GhWRKY32，GhWRKY33和GhWRKY34。我們進(jìn)一步在棉花公共EST資料庫(kù)中篩查相關(guān)的WRKY cDNA序列，通過(guò)電子克隆的方法，獲得另外22個(gè)GhWRKY基因(cDNA)。這26個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，

6、ORF)分別為495bp-1302bp，編碼蛋白長(zhǎng)度為165-434個(gè)氨基酸。這些WRKY蛋白的氨基酸序列中均含有WRKY結(jié)構(gòu)域(WRKYGQK基序)，C端具有典型的鋅指序列結(jié)構(gòu)C2H2或C2HC。
　　根據(jù)GhWRKY蛋白所含有的WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指序列結(jié)構(gòu)類型，可將這26個(gè)GhWRKY蛋白分為三大類，其中有5個(gè)蛋白歸屬于Ⅰ類，5個(gè)歸屬Ⅲ類，其他16個(gè)歸屬于Ⅱ類。根據(jù)Ⅱ類所含有的氨基酸不同，又可將其細(xì)分為Ⅱa，Ⅱb，Ⅱc，

7、Ⅱd和Ⅱe五個(gè)亞類。
　　2、GhWRKY基因在棉花中的表達(dá)分析
　　為研究所分離的26個(gè)WRKY基因在棉花中的表達(dá)譜，我們提取棉花不同組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析。結(jié)果表明，大多數(shù)GhWRKY基因均在營(yíng)養(yǎng)組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，尤其是在根、葉、子葉和下胚軸組織中表達(dá)量相對(duì)較高。有2個(gè)基因(GhWRKY12/16)在開(kāi)花后3-10天的棉纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，表明這些基因可能在起始和伸長(zhǎng)期的棉纖

8、維細(xì)胞中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。
　　已有研究報(bào)道表明WRKY在非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。為研究所分離的26個(gè)WRKY基因是否也受非生物脅迫誘導(dǎo)，我們將在1/2MS上生長(zhǎng)7天的棉花幼苗分別移至含有150 mM NaCl，250 mM甘露醇，100μMABA的1/2MS液體培養(yǎng)基中處理5h，然后提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析。結(jié)果表明，在棉花根中，GhWRKY14/20/24/33/34在三種脅迫處理下

9、其轉(zhuǎn)錄水平得到顯著升高，GhWRKY9/10的表達(dá)水平受ABA和甘露醇的誘導(dǎo)，GhWRKY11/13在NaCl和甘露醇兩種脅迫處理中，其表達(dá)量均大幅度提高。此外，GhWRKY12/15/16/21/30/32只受NaCl的誘導(dǎo)，GhWRKY17/29只受甘露醇的誘導(dǎo)，GhWRKY19/23只受ABA的誘導(dǎo);在棉花子葉中，58％的GhWRKY基因在三種脅迫處理下，其表達(dá)量均受到上調(diào);在棉花下胚軸中，僅有Gh WRKY11的表達(dá)量在三種脅迫

10、處理下得到上調(diào)，Gh WRKY11/13/16/20/24/26/29/30/33/34在ABA和NaCl處理下均上調(diào)其表達(dá)量，Gh WRKY12/31/32僅在NaCl處理下，其表達(dá)量才得到上調(diào)。綜上結(jié)果表明，在棉花生長(zhǎng)發(fā)育中，GhWRKY基因?qū)Ψ巧锩{迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。
　　3、GhWRKY31/34蛋白亞細(xì)胞定位分析
　　構(gòu)建了由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhWRKY基因與綠色熒光蛋白(eGFP)報(bào)告基因融合

11、表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，利用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得GhWRKY31-GFP和GhWRKY34-GFP轉(zhuǎn)基因植株，用轉(zhuǎn)基因植株T2代進(jìn)行表型分析。將T2代種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，待小苗生長(zhǎng)5天后，在共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥小苗根細(xì)胞的GFP熒光信號(hào)，結(jié)果表明GFP熒光信號(hào)主要積聚在細(xì)胞核內(nèi)。上述結(jié)果證明GhWRKY31/34蛋白定位于細(xì)胞核。
　　4、GhWRKY蛋白轉(zhuǎn)錄自激活分析
　　為研究GhWRKY蛋

12、白是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，構(gòu)建了6個(gè)基因(GhWRKY12/16/31/32/33/34)的酵母表達(dá)載體(pGBKT7-GhWRKY12/16/31/32/33/34)，分別轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109和Y187，將轉(zhuǎn)AH109的陽(yáng)性單菌落分別在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His平板上劃線培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)Y187陽(yáng)性單菌落進(jìn)行X-Gal濾紙顯色分析。結(jié)果表明GhWRKY31/33蛋白具有轉(zhuǎn)錄自激活效應(yīng)，GhWRKY12/16/3

13、2/34不具有轉(zhuǎn)錄自激活效應(yīng)。
　　5、過(guò)量表達(dá)GhWRKY轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗鹽性分析
　　構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)GhWRKY12/31/34載體，通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得這3個(gè)WRKY基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。通過(guò)多代(T1-T3代)分析表明，正常生長(zhǎng)條件下，過(guò)量表達(dá)GhWRKY12、GhWR31和GhWRKY34的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長(zhǎng)發(fā)育正常，與野生型植株相同。通過(guò)qRT-PCR分析表明，在棉花中GhWRKY12/31/34基

14、因表達(dá)都受到鹽脅迫誘導(dǎo)，因而推測(cè)這3個(gè)基因可能參與了植物鹽脅迫應(yīng)答過(guò)程。因此，我們分別用100、150和200 mM NaCl處理轉(zhuǎn)基因植株，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率和幼苗綠葉率、根長(zhǎng)，測(cè)定幼苗葉片葉綠素含量以及鹽脅迫相關(guān)基因的表達(dá)變化等指標(biāo)。結(jié)果表明，與野生型相比較，GhWRKY12/34轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐鹽性增強(qiáng)，而GhWRKY31轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在種子萌發(fā)期對(duì)鹽脅迫的耐受性有所提高，但在幼苗生長(zhǎng)期對(duì)鹽脅迫敏感。
　　6、GhWRKY轉(zhuǎn)