干擾Cyt-c表達(dá)對(duì)AfMNPV誘導(dǎo)斜紋夜蛾細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、Cyt-c是一類水溶性蛋白,是由核基因編碼合成,依附在線粒體內(nèi)膜表面。Cyt-c作為一種載體,在呼吸鏈電子傳遞過(guò)程起重要作用。一旦Cyt-c功能出現(xiàn)障礙或是Cyt-c缺失,將會(huì)致使呼吸鏈功能出現(xiàn)異常,進(jìn)而引起ATP缺乏,最終使細(xì)胞出現(xiàn)死亡。此外,Cyt-c由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)也是線粒體介導(dǎo)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最重要事件,即通過(guò)caspase等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管在哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡研究中已經(jīng)證實(shí)Cyt-c能由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡

2、,但昆蟲細(xì)胞凋亡中是否也存在同樣的途徑并不沒(méi)完全闡明。在雙翅目昆蟲細(xì)胞凋亡研究中,關(guān)于Cyt-c的作用存在一些不同結(jié)果。到目前為止,普遍性認(rèn)為Cyt-c不會(huì)從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì),caspase的活化與細(xì)胞凋亡也不依靠細(xì)胞Cyt-c。然而,鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果卻與雙翅目體系相反的結(jié)論。如:利用2-dexory-D-ribose誘導(dǎo)舞毒蛾IPLB-LdFB細(xì)胞的細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)了Cyt-c的釋放和caspase-3的活性；紫外線誘導(dǎo)S

3、f9細(xì)胞凋亡,Western雜交檢測(cè)到Cyt-c由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì),且能激活相關(guān)的凋亡蛋白。同時(shí),桿狀病毒P35基因的表達(dá)會(huì)抑制Cyt-c從線粒體釋放出來(lái)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室利用桿狀病毒處理鱗翅目斜紋夜蛾SL-1細(xì)胞,Cyt-c會(huì)由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中,且能激活caspase-3的活化。但是這些研究主要建立在western雜交上,需要利用其他方法驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)室已利用RNAi技術(shù)研究Cyt-c在SL-1細(xì)胞凋亡體系的作用。研究發(fā)現(xiàn)

4、,利用RNAi沉默SL-1細(xì)胞的Cyt-c表達(dá)后,再經(jīng)桿狀病毒處理細(xì)胞,Cyt-c的mRNA水平降低、caspase-3的活性有所降低等。
　　 在前期的研究基礎(chǔ)之上,我們繼續(xù)采用RNAi技術(shù)進(jìn)一步研究Cyt-c在鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡中作用。利用體外轉(zhuǎn)錄的方法,合成相應(yīng)的dsRNA；用雙染(AnnexinV-FITC和PI)對(duì)經(jīng)RNAi處理的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)；經(jīng)RNAi干擾,病毒誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞后,分析caspas-9的活性等

5、。
　　 從形態(tài)上,利用顯微鏡觀察經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞,我們可以發(fā)現(xiàn)RNAi沉默Cyt-c的表達(dá),細(xì)胞凋亡數(shù)量減少,凋亡小體和半月牙變少等。同時(shí),不同時(shí)間段(24h、48h和72h)轉(zhuǎn)染dsRNA,應(yīng)用DNA電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Cyt-c dsRNA的細(xì)胞DNA片段化程度相對(duì)較低。
　　 采用Annexin V-FITC和PI對(duì)處理細(xì)胞進(jìn)行雙染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到轉(zhuǎn)染eGFP dsRNA48h、Cyt-c dsRNA48h然

6、后接種病毒和只加病毒處理的細(xì)胞凋亡率分別約為67.49％、51.88％和63.2％。
　　 利用caspase-9的特異性底物與提取蛋白反應(yīng)后,熒光分光光度計(jì)測(cè)值。正常細(xì)胞的caspase-9值很低。轉(zhuǎn)染eGFP dsRNA48h、Cyt—c dsRNA48h然后接種病毒和只加病毒處理的caspase-9活性約分別為108.3、72和102.3。顯然,沉默細(xì)胞色素的表達(dá)抑制caspase-9活性說(shuō)明caspase-9活性是細(xì)胞色