尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種T-DNA插入突變體庫的構建及部分致病相關突變體插入位點的定位.pdf

1、香蕉枯萎病是一種系統性維管束病害,用化學農藥很難防治,又因為其傳播容易且速度快,給香蕉種植業(yè)帶來毀滅性打擊。本研究首先從海南省不同市縣采集不同地理來源的香蕉枯萎病菌4號小種,通過經典病理學與分子生物學的方法對這些香蕉枯萎病的病原進行了鑒定;經過致病性測定后發(fā)現不同來源的菌株致病性方面存在差異,并從中篩選出致病性強且生長旺盛的菌株193-6作為插入突變的原始野生型菌株。在進行突變體庫的構建之前,優(yōu)化了農桿菌介導的該生理小種的轉化體系,優(yōu)化

2、后4號生理小種的轉化效率達到700-800個轉化子/106個香蕉枯萎病菌孢子。PCR驗證表明外源的T-DNA已經成功地整合到病原菌基因組中。應用該轉化體系已建立了包含2520個轉化子的突變體庫,并且已經完成了所有轉化子的單孢分離、致病性測定以及部分致病性變化顯著突變體的側翼序列克隆工作。取得的研究結果如下:
　　 1、從海南省不同市縣采集到具有香蕉枯萎病癥狀的香蕉假莖材料,分離純化得到17株香蕉枯萎病菌,經顯微觀察、分子檢測以及

3、柯赫法則鑒定后確定17株病原菌均為香蕉枯萎病菌,其中10株為香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株,7株為1號生理小種。從這些4號生理小種菌株中挑取致病力和生活力都較強的單孢菌株193-6,用作T-DNA插入遺傳轉化的野生型菌株。
　　 2、大規(guī)模構建突變體庫前,對ATMT轉化條件進行了優(yōu)化,優(yōu)化后的轉化體系轉化效率非常高。優(yōu)化后的最佳條件分別是:誘導劑AS的濃度為150μmol/mL,AS誘導前IM培養(yǎng)基中的農桿菌濃度OD600為0.1

4、5,農桿菌經IM液體培養(yǎng)基AS誘導的時間為7個小時,Focr4孢子濃度為1×107個/mL,培養(yǎng)溫度為25℃,誘導培養(yǎng)基pH值為5.5,共培養(yǎng)時間為48小時。
　　 3、通過潮霉素抗性篩選,獲得抗性遺傳穩(wěn)定的突變菌株2520個,本實驗對2520個轉化子進行了單孢分離及致病力的檢測。
　　 4、通過致病性測定方法的摸索,找到了首先離體葉片粗篩,組培苗復篩,大田實驗最后確認突變體致病性變化的高通量突變體致病性測定方法。