大蒜重金屬抗性基因的克隆及其功能分析.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothionein，MT)和植物絡(luò)合素(phytochelatin，PC)是植物中能夠與金屬離子結(jié)合的兩大類(lèi)多肽。研究重金屬脅迫下這兩類(lèi)基因的表達(dá)對(duì)了解植物的重金屬抗性的分子機(jī)制具有重要意義，同時(shí)還可以為培育能用于植物修復(fù)的品種提供新思路。
　　 本論文從大蒜中克隆了一個(gè)type2 MT基因，命名為AsMT2a，將其在大蒜中的表達(dá)模式與大蒜的植物絡(luò)合素合酶基因(AsPCS1)進(jìn)行了比較，并對(duì)二者的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)

2、基因擬南芥的重金屬抗性進(jìn)行研究。其主要結(jié)果如下：
　　 1.AsMT2a基因全長(zhǎng)525 bp，編碼79個(gè)氨基酸，其中有14個(gè)Cys殘基。推測(cè)的氨基酸序列分析表明其Cys的位置和數(shù)目與來(lái)自其它植物的type2 MT蛋白的完全一致。v2.RT-PCR的結(jié)果顯示，大蒜根部AsPCS1的表達(dá)在Cd處理的短期(1 hr)內(nèi)迅速增強(qiáng)，同時(shí)PCs含量也大幅度增加。但AsMT2a的表達(dá)在Cd處理10 hr后才有明顯的增加。說(shuō)明AsPCS1可能在

3、植物對(duì)重金屬的快速響應(yīng)方面起主要作用，而AsMT2a則在植物對(duì)重金屬長(zhǎng)久耐性方面起更大作用。暗示在大蒜暴露于Cd脅迫的不同時(shí)期AsPCS1和AsMT2a基因可以互相協(xié)調(diào)而對(duì)重金屬脅迫作出反應(yīng)。v3.將AsPCS1和AsMT2a轉(zhuǎn)入對(duì)砷和鎘敏感的酵母菌株FD236-6A中，對(duì)轉(zhuǎn)化子的重金屬抗性實(shí)驗(yàn)表明這兩個(gè)基因均可提高轉(zhuǎn)化子對(duì)砷和鎘的抗性。
　　 4.在Cd脅迫下，AsPCS1的超表達(dá)擬南芥的生長(zhǎng)好于野生型植株，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因擬

4、南芥的根較長(zhǎng)，根數(shù)目較多；但在As脅迫下AsPCS1轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株沒(méi)有明顯的差別。與此不同的是將AsMT2a轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株的As抗性明顯增強(qiáng)
　　 5.Cd脅迫下，所有的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Cd的積累量均明顯增加，其中AsPCS1過(guò)表達(dá)植株Cd含量增加最多，平均比野生型對(duì)照增加4倍。而AsMT2a過(guò)表達(dá)植株的Cd積累量的增加幅度較小，約比野生型對(duì)照增加1.4倍。雙價(jià)基因AsMT2a+AsPCS1過(guò)表達(dá)植株的Cd積累量也

5、增加，是野生型的5.8倍，是AsMT2a過(guò)表達(dá)植株的2.4倍，是AsPCS1過(guò)表達(dá)植株的1.2倍。
　　 在克隆AsMT2a的同時(shí)，我們還從大蒜中克隆到了一個(gè)金屬硫蛋白基因家族的新成員，命名為AsMT2b，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步探討。主要結(jié)果如下：
　　 1.AsMT2b全長(zhǎng)520 bp，編碼80個(gè)氨基酸，其中含有15個(gè)Cys殘基。對(duì)推測(cè)的氨基酸序列分析表明AsMT2b的N端和C端domain內(nèi)，Cys的數(shù)目和排列方式與其

6、它type2 MT蛋白明顯不同。暗示AsMT2b可能具有與其它MT不同的生物學(xué)功能。
　　 2.在較低濃度Cd(200μM)脅迫下，AsMT2b的表達(dá)量隨著處理時(shí)間(24hr內(nèi))的延長(zhǎng)而降低，但隨著處理濃度的升高(500μM)和處理時(shí)間延長(zhǎng)(48hr)，其表達(dá)量又逐步增強(qiáng)，說(shuō)明AsMT2b可能在脅迫強(qiáng)度增加到一定程度時(shí)才起作用。
　　 3.將AsMT2b轉(zhuǎn)入對(duì)Cd和As敏感的酵母菌株FD236-6A中，發(fā)現(xiàn)AsMT2b對(duì)

7、酵母As抗性的提高貢獻(xiàn)不大，但可明顯提高酵母對(duì)Cd的抗性。
　　 4.對(duì)AsMT2b的超表達(dá)擬南芥的重金屬抗性分析表明，與野生型植株比較，轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的Cd抗性，但在As脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)和野生型沒(méi)有明顯差異。可以看出，轉(zhuǎn)AsMT2b的擬南芥對(duì)重金屬的抗性不同于轉(zhuǎn)AsMT2a的植株，前者的抗Cd性較強(qiáng)，而后者的抗As性較強(qiáng)。另外，Cd脅迫下，AsMT2b過(guò)表達(dá)擬南芥的Cd含量明顯增加。
　　 另外，我們還對(duì)C

8、dCl2脅迫下，大蒜幼苗中鎘的積累及氧化脅迫和抗氧化能力的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明在CdCl2脅迫下，大多數(shù)Cd在根部積累，而只有少量的Cd積累于葉片中。同時(shí)膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物積累，抗氧化酶活性發(fā)生變化。這些結(jié)果說(shuō)明鎘脅迫下，植物細(xì)胞中氧化脅迫加劇，而抗氧化酶活性的增強(qiáng)是植物對(duì)次生氧化脅迫的一種適應(yīng)策略。
　　 綜上所述，在重金屬脅迫下，AsPCS1和AsMT2a之間及AsMT2a和AsMT2b之間均表現(xiàn)出明顯的協(xié)調(diào)反應(yīng)。這種協(xié)調(diào)反