外源dsRNA抗甘蔗花葉病毒干擾調控研究.pdf

1、玉米（Zea mays L.）是重要的糧食作物與飼料作物，也是現(xiàn)代蔬菜、食品、醫(yī)藥與化學工業(yè)的重要原料。然而，玉米病害尤其是玉米矮花葉病成了限制我國玉米產量與質量的重要因素。傳統(tǒng)的育種方法由于抗性資源的匱乏及物種間的遺傳隔離，使抗病育種工作受到了極大的限制。利用基因工程技術對玉米進行遺傳改良，以增強玉米抗病蟲與耐逆境能力，提高產量，改善品質，這成為玉米遺傳育種的一個新方向。植物抗病毒基因工程的策略有多種，研究表明利用RNAi 原理介導的

2、抗病性特異性強，比較容易獲得高抗甚至免疫的轉基因植株，為作物抗病毒基因工程提供了更有效的途徑。本文利用RT-PCR擴增甘蔗花葉病毒cp基因特異性干涉片段，構建原核表達載體LMCP，利用IPTG 誘導表達，并對誘導條件進行優(yōu)化，利用細菌表達的dsRNA提取液處理玉米植株，分析外源dsRNA 抗SCMV的效果。結果表明：
　　 1、根據甘蔗花葉病毒cp基因序列設計特異性引物，RT-PCR擴增甘蔗花葉病毒cp基因上游及下游147 bp

3、和140 bp的干涉片段。
　　 2、利用pUCCRNAi 克隆載體構建甘蔗花葉病毒cp基因反向重復序列克隆載體pUCCRNAi+2 F，再插入到原核表達載體L4440中，構建原核表達載體LMCP，轉化大腸桿菌HT115。
　　 3、利用IPTG 誘導并對誘導條件進行優(yōu)化，結果表明，LMCP在大腸桿菌HT115(DE3)菌株中可表達產生預期大小的dsRNA 片段。而且當IPTG 濃度為0.4~0.6 mmol/L，誘導4

4、 h 左右時表達量最高。
　　 4、利用不同細菌表達的dsRNA 提取液噴灑4 葉期玉米植株，結果發(fā)現(xiàn)，LMCP1dsRNA 及LMCP2 dsRNA 對甘蔗花葉病毒的干涉效果明顯，而且LMCP1dsRNA的處理效果較LMCP2的好。
　　 5、通過對dsRNA的處理濃度、接種病毒的時間（持效期）、滲透性等參數進行優(yōu)化。結果表明，外源dsRNA 提取液對甘蔗花葉病毒具有免疫作用，當dsRNA稀釋1/5以內時，對病毒侵染的