雙孢蘑菇耐熱分子機(jī)理研究及相關(guān)基因的克隆與功能驗證.pdf

1、高溫脅迫(Heat stress,HS)指生物體處于超過其適宜溫度范圍的環(huán)境下所受到的一種非生物脅迫(Abiotic stress),它能破壞生物體正常的細(xì)胞動態(tài)平衡,導(dǎo)致生物體嚴(yán)重的生長、發(fā)育停滯,甚至死亡。隨著溫室效應(yīng)的影響和全球變暖的趨勢,高溫脅迫以及與之緊密關(guān)聯(lián)的干旱、滲透等脅迫已經(jīng)成為導(dǎo)致全球性農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因。本文主要研究高溫脅迫對雙孢蘑菇的損害,以及耐溫雙孢蘑菇菌株02對高溫的響應(yīng)和抵御機(jī)制;同時探討了應(yīng)用分子生物學(xué)和

2、基因工程技術(shù)培育耐高溫雙孢蘑菇品種的可能性。
　　 雙孢蘑菇[Agaricus bisporus Lange(Imbach),]是具有高經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)意義的栽培食用菌。雙孢蘑菇屬穩(wěn)溫結(jié)實性的菌株,溫度是影響其生長的主要因素,因此培育種性優(yōu)良的耐高溫菌株是促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根本。本課題選取同一家系內(nèi)遺傳背景最為接近的兩株雙孢蘑菇—02菌株和8213菌株8213菌株是常規(guī)栽培菌株,其只能在16-22℃下栽培,而02菌株是顯著耐溫菌株,其

3、菌絲體在33℃下仍然能保持正常狀態(tài))—作為比較研究的對象,探索生物體自身對高溫脅迫的響應(yīng)及防御機(jī)制。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析,我們構(gòu)建了兩個熱激轉(zhuǎn)錄差減文庫,富集了197個耐溫相關(guān)的差異EST片段。經(jīng)過進(jìn)一步的序列比對分析和功能注釋、聚類,結(jié)果顯示差異基因主要為:分子伴侶類、能量及物質(zhì)代謝類、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類、損傷修復(fù)類等。結(jié)合雙孢蘑菇熱激蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果,我們描繪了雙孢蘑菇耐溫菌株02自身的高溫脅迫抵御網(wǎng)絡(luò)模型。這個模型揭示了熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo),核

4、酸損傷修復(fù),以及蛋白質(zhì)修復(fù)和周轉(zhuǎn)三大系統(tǒng)在生物體高溫抵御過程的角色和協(xié)同作用,將熱激后單個基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)變化與生物體系統(tǒng)整體的脅迫動態(tài)平衡有機(jī)聯(lián)系在一起。高溫抵御模型的提出不僅豐富了我們對高等真菌耐高溫機(jī)制和通路的認(rèn)識,而且為進(jìn)一步的機(jī)理研究提供了一個清晰的提綱。
　　 在高溫抵御模型及耐溫基因熱激時空轉(zhuǎn)錄譜的基礎(chǔ)上,我們克隆了處于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點位置的15個重要耐溫相關(guān)EST的全基因序列。我們應(yīng)用逐漸完善的轉(zhuǎn)基因技術(shù),通過轉(zhuǎn)基因過

5、表達(dá)和反向遺傳學(xué)抑制基因表達(dá)的方法在雙孢蘑菇及模式物種擬南芥中開展耐高溫表型功能驗證。結(jié)果顯示,有4個基因的過表達(dá)對高溫敏感的雙孢蘑菇8213的耐溫特性起到了明顯的促進(jìn)作用,它們是對氨基苯甲酸合成酶基因(Pab)、脯氨酸順反異構(gòu)酶基因(Ppi)、疏水蛋白基因(Hpb)和Calnexin基因,在反向遺傳學(xué)研究中,我們發(fā)現(xiàn)抑制疏水蛋白基因(Hab)表達(dá)起到了明顯的降低02菌株耐高溫特性的作用,反向的結(jié)果印證了Hab基因在促進(jìn)雙孢蘑菇02高溫

6、耐受性上的突出作用;擬南芥中的表型功能驗證顯示Pab、Ppi、Hpb以及一種免疫調(diào)節(jié)蛋白能夠顯著增強野生型擬南芥幼苗的基礎(chǔ)耐溫性。
　　 我們在擬南芥中研究了PABA合成酶的耐高溫機(jī)制。在表型上,外源直接添加PABA(1-5μmol/L)能夠直接促進(jìn)擬南芥的耐溫性;同時,內(nèi)源過表達(dá)PABA合成酶的轉(zhuǎn)基因植株(35S:AbPabase)的基礎(chǔ)耐溫性也明顯優(yōu)于野生型植株。通過深入研究,我們發(fā)現(xiàn)熱激能夠促進(jìn)擬南芥H2O2產(chǎn)生,同時轉(zhuǎn)基

7、因植株(35S:AbPabase)中的本底H2O2水平顯著高于野生型。此外,轉(zhuǎn)基因植株(35S:AbPabase)中熱休克蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào),這一現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在生長于外源添加PABA(5μmol/L)的野生型擬南芥小苗中。從以上結(jié)果中,我們認(rèn)為在擔(dān)子菌和高等植物中存在著一條“PABA-H2O2-Peroxide signaling-HSPsexpression-Thermotolerance”的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在這個通路里,PABA作