18個(gè)水稻W(wǎng)RKY基因的克隆和OsWRKY21功能分析.pdf

1、植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗和適應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫中起著重要的作用。為了探討水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子在水稻抗逆反應(yīng)中所擔(dān)負(fù)的獨(dú)特生物學(xué)功能，本研究通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆獲得到OsWRKY3、OsWRKY7、OsWRKY10、OsWRKY11、OsWRKY14、OsWRKY26、OsWRKY29、OsWRKY34、OsWRKY40、WRKY46、Os WRKY50、Os WRKY55、Os WRKY61、Os WRKY67、Os WR

2、KY72、OsWRKY77、OsWRKY86和OsWRKY87這18個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列。然后，構(gòu)建其中8個(gè)基因的植物過(guò)量表達(dá)載體和RNAi基因沉默載體，另外構(gòu)建5個(gè)基因的過(guò)量表達(dá)載體，用于水稻轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。并且，應(yīng)用半定量RT-PCR初步分析了上述部分OsWRKY基因在BTH、JA和ABA這3種信號(hào)因子脅迫下的基因表達(dá)譜。結(jié)果表明，OsWRKY72的表達(dá)受BTH、JA和ABA誘導(dǎo)均表現(xiàn)明顯上調(diào)，OsWRKY50和OsWRKY86的表達(dá)

3、受BTH、JA誘導(dǎo)均表現(xiàn)明顯上調(diào)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型分析工作表明OsWRKY21在水稻抗酸雨脅迫中起正調(diào)控作用，在本論文中對(duì)OsWRKY21在水稻應(yīng)答酸雨脅迫的分子機(jī)制中的調(diào)控作用進(jìn)行研究。首先采用熒光定量PCR技術(shù)分析了pH3.0和pH2.5的模擬酸雨噴施誘導(dǎo)OsWRKY21基因表達(dá)的詳細(xì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)2個(gè)pH值的模擬酸雨都可以快速誘導(dǎo)OsWRKY21表達(dá)，在0.5h表達(dá)量達(dá)到最高。之后，構(gòu)建OsWRKY21-

4、GFP融合載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只在細(xì)胞核處出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，證實(shí)OsWRKY21具有定位到細(xì)胞核的能力。
　　 為篩選受OsWRKY21調(diào)控的下游靶基因，采用Affymetrix全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)OsWRKY21過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株系進(jìn)行了分析，在表達(dá)量上調(diào)2倍以上的基因中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)過(guò)氧化物酶基因(Os01g2249、Os06g20150、Os04g59150)、2個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因(Os01g72170、Os10

5、g38780)和4個(gè)細(xì)胞色素P450基因(Os03g44740、Os01g59000、Os09g10340、Os10g30410)共9個(gè)基因可能與水稻抗酸雨途徑相關(guān)。進(jìn)而采用熒光定量PCR分析這9個(gè)候選基因在OsWRKY21過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量，以及酸雨處理后的野生型植株和RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Os03g44740、Os01g2249、Os01g59000、Os09g10340、Os10g30410、Os01

6、g72170和Os10g38780這7個(gè)基因在過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)上調(diào)，在野生型植株中受pH2.5模擬酸雨誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，且在pH2.5模擬酸雨處理后的RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量下降，所以這7個(gè)基因可能是OsWRKY21直接或間接調(diào)控的下游靶基因。
　　 綜上所述，本論文對(duì)18個(gè)OsWRKY基因的克隆、載體構(gòu)建和表達(dá)譜分析為后續(xù)開展這些基因的功能研究工作打下了基礎(chǔ)。并且，本論文發(fā)現(xiàn)OsWRKY21可以直接或間接調(diào)控3個(gè)活性氧清