Bacillus subtilis ZJU15產(chǎn)生的抗菌肽研究.pdf

1、從水稻葉片中分出一株具有較好抗菌活性的細(xì)菌菌株ZJU15，經(jīng)常規(guī)的生理生化鑒定、顯微鏡觀察和16s rDNA部分序列的檢測(cè)分析，將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。經(jīng)作用譜測(cè)定，該菌株的培養(yǎng)去菌液能夠有效抑制多種食品腐敗和致病革蘭氏陽性細(xì)菌，如單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、糞腸球菌(Enterococcus feacal

2、is)、金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pyogenes)等，但該培養(yǎng)去菌液對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌沒有抑制作用。此外，該菌株的培養(yǎng)去菌液對(duì)引起柑橘采后腐敗的意大利青霉(Penicillium digitatum)、引起多種食品霉變的黃曲霉(Aspergillus flavus)和水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)等也具有明顯的抑制作用，但對(duì)酵母樣真菌念珠菌(

3、Candida spp.)沒有抗菌作用。
　　 通過不同配方培養(yǎng)基的培養(yǎng)比較研究，確定CM培養(yǎng)基最適合ZJU15菌株抗菌物質(zhì)產(chǎn)生。通過生長曲線和活性曲線測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌株在培養(yǎng)30小時(shí)左右去菌培養(yǎng)液具有最大的抗菌活性。不同硫酸銨飽和濃度沉淀試驗(yàn)結(jié)果顯示20％-30％的硫酸銨飽和濃度能使ZJU15菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)得到最大程度的沉淀。在此基礎(chǔ)上，將ZJU15菌株接種于液體培養(yǎng)中，35℃下振蕩培養(yǎng)30小時(shí)，所得發(fā)酵液通過離心去菌、硫酸

4、銨沉淀、Superdex75 prep grade柱層析和RP-HPLC色譜(Hypersii ODS2色譜柱)純化，獲得三個(gè)具有抗菌活性的洗脫峰。它們的洗脫時(shí)間分別為11.762Min，12.767Min，14.340Min，分別命名為ZJU15A、ZJU15B和ZJU15C。將所得的抗菌肽提交中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜掃描分析(掃描范圍50-5000Da)、Q-TOF2一級(jí)質(zhì)譜掃描得

5、到LC-ESI-MS圖。選擇待測(cè)離子，然后進(jìn)行ESI-MS/MS分析。結(jié)果顯示ZJU15菌株產(chǎn)生的三個(gè)抑菌活性成分的分子量分別為1021.70Da，1021.71 Da和1035.69Da；它們的氨基酸序列分別為：LLELLVPLL，LLELLVPLL和LTHMLVPLL。經(jīng)BLAST序列查詢，沒有發(fā)現(xiàn)SWISS-PROT/TrEMBL數(shù)據(jù)庫中相似抗菌肽序列存在，我們認(rèn)為它們?yōu)樾碌目咕摹?br>　　 ZJU15菌株的培養(yǎng)去菌液經(jīng)蛋白

6、酶K處理后完全失去抑菌活性；對(duì)蛋白酶E部分敏感，但對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感。不同pH值處理的結(jié)果顯示，在pH2-10之間ZJU15菌株的培養(yǎng)去菌液保持抑菌活性不變，在pH11、pH12處理下抑菌活性顯著下降。ZJU15菌株的培養(yǎng)去菌液經(jīng)37℃、60℃、80℃、100℃、121℃(高壓)各處理30min，其抑菌活性保持不變。
　　 將不同濃度的抑菌物質(zhì)粗提液加入到對(duì)數(shù)生長中期單增李斯特菌液中，24h后涂板測(cè)定菌落總數(shù)。結(jié)果顯示5

7、12AU/ml的活性濃度是對(duì)對(duì)數(shù)生長中期單增李斯特菌的最小殺菌濃度，256AU/ml的活性濃度是對(duì)對(duì)數(shù)生長中期單增李斯特菌的最小抑菌濃度。對(duì)數(shù)生長中期的單增李斯特菌經(jīng)512AU/ml活性濃度的抑菌物質(zhì)粗提液處理后，經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：單增李斯特菌的菌體邊緣模糊、空泡化、胞壁缺陷。此結(jié)果表明，ZJU15菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)能夠?qū)е聠卧隼钏固鼐?xì)胞壁破裂或者形成孔洞，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。
　　 棋盤法聯(lián)合測(cè)定抑菌活

8、性研究結(jié)果表明：乳酸鏈球菌素和ZJU15菌株培養(yǎng)去菌液具有協(xié)同增效作用；
　　 經(jīng)ZJU15菌株抑菌物質(zhì)粗提液對(duì)小鼠急性經(jīng)口灌胃毒性試驗(yàn)，初步表明最高劑量50ml/kg的ZJU15菌株抑菌物質(zhì)粗提液沒有造成雌雄小鼠死亡和異常，即ZJU15菌株抑菌物質(zhì)粗提液的急性經(jīng)口LD50>50000mg/kg，ZJU15菌株抑菌物質(zhì)粗提液對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性屬無毒。
　　 為了評(píng)估ZJU15菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)食品的防腐保鮮效果，我們

9、以臘肉、豆?jié){和牛奶為材料進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明經(jīng)終濃度為512AU/g或1024AU/g的抑菌粗提物處理的未加工臘肉，在37℃保存條件下，7天后出現(xiàn)白色菌斑，而滅菌水對(duì)照3天就出現(xiàn)白色菌斑；經(jīng)終濃度1024AU/ml和512AU/ml的抑菌粗提物處理新鮮豆?jié){，在37℃的條件下放置16h后沒有檢測(cè)到微生物的存在。商品純牛奶經(jīng)終濃度1024AU/ml的抑菌粗提物處理，可有效減少牛奶中的菌落數(shù)。以上結(jié)果顯示出ZJU15菌株產(chǎn)生的抗菌肽在食品加工