鵝呼腸孤病毒分離鑒定和σC基因克隆、原核表達及抗血清的制備.pdf

1、江蘇某鵝養(yǎng)殖場發(fā)生一種僅感染雛鵝并以出血性壞死性肝炎為特征的病理變化和顯微病理變化的傳染性疾病。本實驗室從發(fā)病鵝場采集患病雛鵝的肝臟為病料，接種SPF雞胚分離病毒，通過臨床癥狀及剖檢病變、序列比對等方法對分離的病毒進行鑒定，結(jié)果表明該分離株病毒屬于呼腸孤病毒。通過絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚、14日齡鵝胚均能引起規(guī)律性死亡和特征性病變，但經(jīng)過尿囊腔途徑接種病毒的雞胚和鵝胚并不會死亡。
　　該尿囊液病毒接種原代雞胚成纖維細胞

2、未觀察到明顯的細胞病變，細胞生長良好。含病毒的尿囊液、絨毛尿囊膜及胚體對雞胚、鵝胚的半數(shù)致死量(LD50)分別為10-2.76、10-3.18、10-3.9、10-4.3、10-3.7、10-4.2;用收集的尿囊液接種1、30、80日齡鵝，1日齡雛鵝部分發(fā)病死亡，其他鵝均無明顯的臨床癥狀。另外，血凝試驗驗證了該病毒無血凝性。
　　ARV的σC蛋白是S1基因的第三個開放性閱讀框編碼的蛋白，有多種存在形式，是ARV外殼蛋白的重要組成部

3、分，σC蛋白可能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。σC蛋白和細胞的吸附性相關(guān)，啟動了病毒的感染過程，第三個ORF基因缺失部分會導(dǎo)致病毒吸附能力的下降，因此σC蛋白在病毒的感染和致病作用上有比較重要的作用。
　　根據(jù)NCBI上已發(fā)表σC基因的基因序列設(shè)計了一對特異性的引物，采用RT-PCR方法擴增σC基因片段，將σC基因與T載體相連，把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含IPTG和X-gal的氨芐LB平板上篩選出白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，

4、然后通過瓊脂糖凝膠電泳進行初步判斷，再送測序鑒定，克隆的基因片段大小為797bp;克隆到pGEX-6P-1表達載體上，獲得重組質(zhì)粒pGEX-σC，將重組質(zhì)粒pGEX-σC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，37℃，0.1mM IPTG誘導(dǎo)5h，通過SDS-PAGE電泳分析證實σC基因獲得了表達，重組蛋白分子量分別約為55KD，命名為GST-σC。以GRV陽性血清為一抗，經(jīng)Western-blot分析證實表達的融合蛋白抗原性良好。

5、　　用重組菌(pGEX-σC)誘導(dǎo)表達融合蛋白(GST-σC)，經(jīng)過純化后的蛋白作為免疫原，免疫2.5kg左右的新西蘭白兔2只。三次免疫后用間接ELISA方法檢測抗體效價，抗體的有效稀釋效價為1∶6400。制備高效價的抗體是驗證基因表達和研究基因功能的首要前提，因為該病發(fā)現(xiàn)相對其他病毒來說的時間還很短，目前對診斷GRV感染的主要方法是病毒的分離鑒定和瓊脂擴散實驗，而融合蛋白的表達和抗血清的制備可促進該蛋白進行抗原性分析、制備GST-σC