家蠶翅突變螯蝦蛹(crayfish，cf)基因的分子定位及候選基因篩查.pdf

1、昆蟲(chóng)早在3.5億年前就出現(xiàn)了。在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，昆蟲(chóng)之所以能成為地球上分布最廣，種類最多的生物類群，其重要的原因之一就是翅的發(fā)生使其在覓食、繁衍、躲避敵害以及擴(kuò)展傳播等多個(gè)方面獲得了獨(dú)特的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷史中，翅的形態(tài)、質(zhì)地、發(fā)達(dá)程度和表面的覆蓋物等特征由于所處環(huán)境的影響發(fā)生了種種適應(yīng)性的變化，從而使昆蟲(chóng)的翅出現(xiàn)許多不同的類型，也產(chǎn)生了各種各樣的變異，如形狀、顏色和斑紋等。對(duì)這些突變材料的研究無(wú)疑能夠?yàn)榧由顚?duì)昆蟲(chóng)翅的發(fā)育和特化

2、、昆蟲(chóng)分類和演化問(wèn)題的認(rèn)識(shí)提供很大的幫助。
　　 家蠶是鱗翅目昆蟲(chóng)的典型模式，在長(zhǎng)期的人工選擇壓力下，已喪失了飛行能力。家蠶翅突變資源非常豐富，其中翅突變螯蝦蛹(cf)是單基因隱性突變，其表型極其特殊：蛹翅膨脹成囊狀，向外側(cè)突出，形似螯蝦的爪鉗；成蟲(chóng)的翅表現(xiàn)為囊泡型，膨脹的囊狀物易破裂出血而導(dǎo)致其死亡。通過(guò)對(duì)家蠶這一典型的翅突變類型的研究，有利于了解和分析家蠶翅發(fā)育過(guò)程中基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，認(rèn)識(shí)其作用的分子機(jī)制，也為鱗翅目害蟲(chóng)的生物

3、防治帶來(lái)新的思路。
　　 因此，本研究利用西南大學(xué)家蠶基因資源庫(kù)保存的珍貴的螯蝦蛹材料，運(yùn)用定位克隆的手段并結(jié)合漸已成熟的信息平臺(tái)，期望為最終解析螯蝦蛹形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。目前，取得的主要結(jié)果如下：
　　 1.翅突變螯蝦蛹基因的分子定位
　　 選用家蠶基因資源庫(kù)的突變系統(tǒng)材料16-060cf和“大造”作為親本，配制連鎖分析組合(BC1F，F(xiàn)1雌回交隱性親本)和定位分析組合(BC1M，F(xiàn)1雄回交隱性親本)。利用

4、家蠶SSR連鎖圖譜第13連鎖群的15對(duì)SSR引物和323個(gè)定位群體，將螯蝦蛹基因(cf)定位在SSR標(biāo)記S2213與S1311之間，標(biāo)記S1309與cf緊密連鎖。cf距離S2213和S1311分別是15.3 cM，7.5 cM。
　　 我們分析了位于S1309標(biāo)記上游2000kb，下游1000kb內(nèi)的基因，進(jìn)行染色體步移。最終將cf定位在基因BGIBMGA001241和基因BGIBMGA001213之間，二者距離cf都為0.6c

5、M，新標(biāo)記S00929與cf也無(wú)交換。其間，一共包含63個(gè)基因，全長(zhǎng)大約1425kb。
　　 2.基于定位結(jié)果的候選基因篩查
　　 根據(jù)分子定位的結(jié)果，對(duì)于鎖定區(qū)域的63個(gè)基因，查找與翅發(fā)育，細(xì)胞粘連、腫瘤形成有作用的基因，共鑒定出了18個(gè)相關(guān)基因。通過(guò)這一分析，我們發(fā)現(xiàn)了2個(gè)非常重要的基因BGIBMGA000910和BGIBMGA000915都編碼層粘連蛋白(laminin)。層粘連蛋白是基膜的主要結(jié)構(gòu)，在引起翅上下表

6、皮的粘連中起重要作用。分別在野生型“大造”和突變體cf中對(duì)這2個(gè)基因的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增分析，在片段大小上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差異。我們又在cDNA水平克隆檢驗(yàn)。我們首先對(duì)基因BGIBMGA000910進(jìn)行了克隆和序列分析，該基因是單外顯子，全長(zhǎng)5340bp，測(cè)序結(jié)果顯示在野生型“大造”和cf之間有2個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改變，但是編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生改變。我們初步推測(cè)由該基因引起cf突變的可能性不大。
　　 同時(shí)，我們對(duì)另外的13個(gè)

7、與翅發(fā)育或與細(xì)胞粘連相關(guān)的基因在基因組上進(jìn)行了擴(kuò)增，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的差異，但由于沒(méi)有在cDNA進(jìn)行克隆和測(cè)序分析，因此，目前還不能完全確定導(dǎo)致cf突變的基因不在這些基因中。
　　 3.候選基因的基因芯片分析
　　 選用野生型“大造”和cf在熟蠶期的翅原基RNA為材料，進(jìn)行全基因組的芯片分析。從5887個(gè)檢測(cè)得到的有效基因中找到了332個(gè)差異表達(dá)基因一共，其中在cf中表達(dá)上調(diào)的基因有174個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有158個(gè)。

8、r>　　 對(duì)這些表達(dá)有差異的基因的分析結(jié)果顯示，其中有2個(gè)基因位于cf基因定位的區(qū)間內(nèi)，分別是BGIBMGA001218和BGIBMGA000915。這2個(gè)基因也在鑒定的18個(gè)基因內(nèi)，并且都是在cf中的的表達(dá)量下調(diào)，這與cf基因由隱性基因控制比較吻合。BGIBMGA001218編碼的是一個(gè)熱激蛋白70(HSP70)，HSP70主要在抗細(xì)胞凋亡、阻止細(xì)胞衰老、激素受體結(jié)合、酶活性的穩(wěn)定及修復(fù)方面發(fā)揮作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)HSP70是與腫瘤轉(zhuǎn)化