大腸桿菌HPI毒力島ybtA、fyuA基因的研究.pdf

1、由大腸桿菌引起的仔豬腹瀉仍是一個(gè)沒有完全解決的問題，給養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失不可低估；新近發(fā)現(xiàn)的攜帶耶爾森氏菌強(qiáng)毒力島(HPI)的大腸桿菌使得仔豬腹瀉的病原更具復(fù)雜性。因此深入研究HPI主要結(jié)構(gòu)基因與HPI毒力島的關(guān)系，以減少HPI毒力島對養(yǎng)豬業(yè)的影響。本實(shí)驗(yàn)主要針對ybtA、fyuA基因進(jìn)行研究。在HPI毒力島中ybtA屬AraC轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)家族。它促進(jìn)fyuA、irp2和irp6啟動(dòng)子的表達(dá)卻抑制自身啟動(dòng)子。fyuA與鐵的吸收有關(guān)，是Ybt、

2、細(xì)菌素以及巴氏桿菌素的外膜受體。
　　 為了進(jìn)一步了解HPI毒力島的生物學(xué)特性，該研究根據(jù)GenBank發(fā)表的大腸桿菌HPI毒力島(high pathogenicity island，HPI)主要結(jié)構(gòu)基因fyuA、ybtA的基因序列，分別設(shè)計(jì)一對特異性表達(dá)引物，經(jīng)PCR方法從大腸桿菌HPI毒力島陽性菌株S711100擴(kuò)增出fyuA1960 bp、ybtA840 bp的基因片段，并定向克隆入載體pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5

3、α；經(jīng)雙酶切獲得目的片段后，分別插入到表達(dá)載體pGEX-6P-1的GST基因下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-fyuA、pGEX-6P-1-ybtA。誘導(dǎo)表達(dá)后重組菌裂解物經(jīng)SDS-PAGE及Western-blot分析證明，獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-fyuA、pGEX-ybtA，分別能夠表達(dá)分子量為98.37 kDa、60 kDa的蛋白，從而為研制抗GST-FyuA、抗GST-YbtA的多克隆

4、抗體提供了抗原。
　　 fyuA、ybtA基因表達(dá)的蛋白都以包涵體形式存在，利用切膠回收的方式純化表達(dá)產(chǎn)物GST-FyuA、GST-YbtA作為免疫原，分別免疫2只質(zhì)量3kg的雄性新西蘭大白兔，進(jìn)行三次免疫，制備兔抗豬GST-FyuA、GST-YbtA蛋白多克隆抗體，用間接ELISA和Western blot進(jìn)行檢測，證明制備的多克隆抗體具有較高的親和性；可以與GST-FyuA、GST-YbtA蛋白特異性結(jié)合。為下一步檢測fyu

5、A、ybtA單基因缺失株提供了多克隆抗體。
　　 為了深入研究ybtA、fyuA與HPI毒力島的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)選擇S711100、S793103兩株HPI+大腸桿菌菌株為對象，利用Red同源重組技術(shù)分別敲出HPI毒力島的關(guān)鍵基因fyuA50 bp-1972 bp序列和ybtA50 bp-910 bp序列，構(gòu)建fyuA和ybtA單基因缺失株。
　　 通過Western blot方法，用實(shí)驗(yàn)中制備的抗GST-YbtA和抗GST