大白菜霜霉菌誘導抑制性消減cDNA文庫的構建及防御相關基因的表達分析.pdf

1、大白菜[Brassica campestris L.ssp.Pekinensi（Lour.）Olsson]是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一，并逐漸成為世界性蔬菜作物。大白菜霜霉病是由霜霉菌（Peronospora parasitica）引起的，從苗期到包心期或種株開花到結莢期均易發(fā)病，該病的發(fā)生會嚴重影響大白菜的產量及品質，因此研究大白菜抗霜霉病機理對大白菜的育種工作具有重要意義。
　　 本研究以抗霜霉病大白菜為材料，構建了霜霉

2、病誘導表達的正向抑制性消減文庫，研究了大白菜在霜霉病誘導下的差異表達基因；同時采用PCR技術克隆了5個防御基因的片段，通過應用熒光定量的方法研究了它們在侵染霜霉菌后的表達情況，為進一步揭示大白菜霜霉病抗性的分子機制及分子標記輔助育種打下良好基礎。主要研究結果如下：
　　 1.以抗霜霉病DH系T12-19為材料，分別用接種大白菜霜霉病菌和噴蒸餾水0、6、12、24、48和72 h的雙鏈cDNA混合池作為Tester和Driver，

3、構建正向消減cDNA文庫。經藍白斑篩選，文庫的重組率為87.3％，獲得陽性克隆768個。文庫的插入片段分布在200-1000 bp，主要集中在200-500 bp。
　　 2.利用反向Northern斑點雜交技術對正向文庫的768個陽性克隆進行了篩選，共荻得57個病原菌誘導上調表達的克??；測序后得到55條通讀EST；對這些EST序列進行聚類和拼接分析，共獲得50個unigenes；經BLAST比對結果表明，37個unigenes

4、與已知基因高度同源，占全部非重復序列的67.3％；對已知功能基因進行功能分類，發(fā)現這些基因的功能主要涉及物質與能量代謝、轉錄調控、蛋白質合成與代謝、膜及轉運、信號轉導、抗病防御等。此外，采用實時熒光定量PCR技術分析了文庫中3個克隆在霜霉菌誘導下的表達譜，結果表明，這3個克隆在接種病菌6 h后明顯上調表達，與反向Northern斑點雜交結果基本一致。
　　 3.采用PCR同源擴增技術克隆了5個候選防御基因PR-1、PR-2（β-

5、1，3-glucanase）、PR-5（thaumatin like）、PAL和F日的cDNA片段。利用熒光定量PCR技術分析了這些防御基因在接種霜霉菌后的表達情況。結果表明，霜霉菌誘導后，2個編碼病程相關蛋白的基因BRPR1和BRPR5在接種霜霉菌12 h后明顯上調，而BRPR2在接種霜霉菌6 h后明顯上調，之后逐漸恢復到正常水平；編碼苯丙氨酸解氨酶的基因BRPAL在接種病菌6 h后明顯上調，12 h后下調表達；花青素早期合成相關基因