雞下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關基因表達的品種差異以及l(fā)eptin的程序化作用.pdf

1、本文首先通過比較蛋雞和肉雞下丘腦食欲(appetite)和能量穩(wěn)態(tài)(energyhomeostasis)調節(jié)相關基因的表達，發(fā)現促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、糖皮質激素受體(GR)、脂肪和肥胖相關(FTO)基因的表達在品種間存在差異。然后檢測了蛋雞和肉雞種蛋內的激素水平，發(fā)現肉雞蛋內含有較高的瘦素（leptin）和皮質酮。根據以往的研究報道，提出蛋中l(wèi)eptin可能通過影響下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關基因的表達對后代生長性能產生程

2、序化影響。為驗證這一假說，設計了蛋內注射leptin及其拮抗劑的試驗，觀察對內雞早期生長發(fā)育影響的同時，下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關基因表達的變化，為揭示母源性leptin對禽類生長程序化影響的機制提供實驗證據。
　　1.蛋雞和肉雞下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關基因表達的比較研究
　　蛋雞和肉雞在體重和身體組成上存在明顯的差異，而這種差異形成的機制還不清楚。本試驗通過對出雛后7日齡(D7)蛋雞和肉雞的比較發(fā)現，肉雞具有較高的體

3、重和采食量(P＜0.001)，但單位體增重的采食量（飼料轉換比，FCR）反而蛋雞較高(P＜0.001)。采用原位雜交和（或）real-time RT-PCR的方法發(fā)現下丘腦中的一些基因如神經肽Y(NPY)、刺鼠相關蛋白(AGRP)、阿黑皮素原(POMC)、食欲素(ORX)、leptin受體(LEPR)和20-羥基類固醇脫氫酶(20HSD)的mRNA表達在品種間都沒有顯著差異(P＞0.05)。下丘腦的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合酶

4、(FAS)的mRNA表達量肉雞有高于蛋雞的趨勢(P＜0.10)。肉雞下丘腦中CRH mRNA(P＜0.05)的表達較蛋雞低，但蛋白水平正好相反(P＜0.01)，表明CRH在轉錄、翻譯和分泌等不同水平的調節(jié)過程中存在差異。肉雞下丘腦中GR mRNA(P＜0.05)和蛋白（P＜0.01）水平均顯著高于蛋雞，說明肉雞下丘腦中由GR介導的負反饋調節(jié)CRH轉錄和釋放功能的增強。此外，FTO基因在肉雞的下丘腦中高表達(P＜0.01)。以上結果揭示了

5、與能量平衡和肥胖相關的基因如GR、CRH、FTO的表達受到遺傳選育的影響，并且可能對雞的體重和長期能量穩(wěn)態(tài)起到重要的調節(jié)作用。
　　2.蛋雞和肉雞下丘腦CRH、GR基因啟動子的甲基化分析及蛋內激素水平的比較
　　本試驗通過比較蛋雞和肉雞下丘腦CRH、GR基因啟動子的甲基化水平以及兩品種雞種蛋內的leptin、皮質酮的水平，來觀察CRH和GR基因表達的品種差異是否伴隨DNA甲基化的差異，并觀察蛋內激素水平在品種間是否不同。甲基

6、化敏感限制性內切酶PCR法的研究發(fā)現，CRH和GR基因啟動子片段的甲基化水平在品種間沒有差異(P＞0.05)。放射免疫分析法（RIA）和酶免疫分析法（EIA）的結果顯示肉雞蛋黃中l(wèi)eptin以及皮質酮的水平均顯著高于蛋雞(P＜0.05)。以上結果提示:蛋中的母源性激素如leptin、皮質酮在品種間存在差異，但這種差異是否與生長和基因表達的品種差異有關還有待進一步研究。
　　3蛋內注射leptin對雛雞下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關基

7、因表達的影響
　　為了探討母源性leptin對三黃肉雞育雛期下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)相關基因表達的影響，本試驗挑選蛋重相近的三黃肉雞種蛋，隨機分為三組:蛋清內注射100μL溶劑(PBS)的對照組（control，Con），leptin處理組分別注射0.5μg/100μL PBS（低劑量組，LL）和5.0μg/100μL PBS（高劑量組，HL）的重組小鼠leptin，出雛后飼養(yǎng)至21日齡時采取樣品。蛋內注射leptin影響肉雞出雛后的

8、早期生長，并呈現性別特異性和劑量依賴性。注射高、低劑量的leptin均使得肉雞出雛重下降，特別是低劑量組母雞(P＜0.01)。育雛期處理組肉雞的生長速度高于對照組，21日齡時處理組肉雞的體重顯著高于對照組(P=0.042，P=0.003)。Real-time RT-PCR和Western blotting方法檢測發(fā)現，leptin注射影響21日齡肉雞下丘腦基因和蛋白的表達，高劑量組公雞表現更為明顯。除了CRH mRNA表達沒有變化外，高

9、劑量組公雞下丘腦中LEPR、FAS、GR的mRNA表達均顯著下調(P＜0.05)。Leptin處理組公雞下丘腦中FTO mRNA的表達均極顯著地升高(P＜0.01)。母雞只有低劑量組GR mRNA的表達顯著下降(P＜0.05)。公雞下丘腦中CRH蛋白含量在高劑量組顯著升高（P＜0.05），GR蛋白水平在高、低劑量組均極顯著升高(P＜0.01)，而母雞無顯著變化(P＞0.05)。原位雜交的結果顯示，GR mRNA廣泛分布于21日齡肉雞腦的

10、各個區(qū)域，主要是大腦紋狀體、丘腦的圓核(ROT)、背外側核(DLN)、卵圓核(OV)、上網狀核(Rsd)等，在下丘腦視前區(qū)(POA)也有較多分布，其次是下丘腦外側區(qū)(LHy)、室旁核（PVN）、室周核(PHN)、腹內側核(VMN).漏斗核（IN）和海馬(Hp)等。其中高、低劑量leptin均使得PVN、PHN和VMN中GR mRNA的表達下調(P＜0.05)，而對LHy、IN和Hp的GR mRNA影響不顯著(P＞0.05)。以上結果提示

11、:蛋內注射leptin影響肉雞育雛期的生長發(fā)育，改變下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關基因的表達，特別是GR的水平。
　　4蛋內注射leptin及其拮抗劑對雛雞下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關基因表達的影響
　　為了進一步探討母源性leptin對三黃肉雞育雛期下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關基因表達的影響機制，本試驗挑選蛋重相近的三黃肉雞種蛋，隨機分為四組:對照組(100μL PBS，Con)、leptin處理組(0.5μg，L)、lep

12、tin拮抗劑組(0.5μg，LA)和leptin+leptin拮抗劑組（各0.5μg，L+LA）。出雛后飼養(yǎng)至21日齡時進行采樣。蛋內注射leptin及其拮抗劑影響肉雞出雛后的早期生長和下丘腦中相關因子的水平，并呈現性別差異。蛋內注射leptin及其拮抗劑后，肉雞的出雛重和Con組相比無明顯差異(P＞0.05)。無論公母，和其它三組相比，蛋內注射leptin顯著提高了肉雞育雛期的體重、相對體增重(P＜0.05)，也提高了育雛期肉雞的采食

13、量，和Con組相比差異顯著(P＜0.05);兩個拮抗劑組和Con組相比，體重、采食量等差異不明顯(P＞0.05)。RIA的結果顯示，21日齡時LA、L+LA組母雞血清中l(wèi)eptin的水平顯著高于Con組和L組(P＜0.05)。Real-time RT-PCR和Western blotting方法檢測發(fā)現，21日齡時L組母雞的GR mRNA表達顯著低于Con組(P＜0.05)。L+LA組公雞LEPR mRNA顯著高于Con組(P＜0.05

14、)，而CRH mRNA水平反而低（P＜0.05）。蛋白水平只有L組公雞的GR升高，顯著高于Con組(P＜0.01)和L+LA組(P＜0.05)。熒光原位雜交(FISH)的結果顯示，和Con組相比，母雞21日齡時L組PVN、PHN中GR mRNA的表達下調(P＜0.05)，L+LA組的GR mRNA在PHN（P＜0.01）和LHy（P＜0.05）表達下調。以上結果基本上重復了leptin蛋注的試驗，并證明了蛋內注射leptin可程序化的影