檉柳Peroxiredoxin基因(ThPrx1)的克隆及抗逆功能分析.pdf

1、本文從檉柳(Tamarix hispida)cDNA文庫(kù)中克隆到了一個(gè)Prx基因(ThPrx1),該基因是活性氧清除酶類過(guò)氧還蛋白(Prx)家族成員。ThPrx1全長(zhǎng)為851 bp,開放讀碼框自165位的ATG起,止于653位的TAA,全長(zhǎng)489 bp,共編碼162個(gè)氨基酸,該蛋白的分子量為17.5KD,理論等電點(diǎn)為6.08。采用Tail-PCP方法擴(kuò)增出ThPrx1基因的啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為1768 bp。
　　 將ThP

2、rx1基因克隆到酵母表達(dá)載體pYES2中,轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),并用轉(zhuǎn)空pYES2載體的酵母作為對(duì)照。分別用NaCl、KCl、Na2CO3、CuSO4、CdCl2、高溫、低溫、山梨醇、甲基紫精脅迫條件處理轉(zhuǎn)ThPrx1基因酵母與對(duì)照(轉(zhuǎn)化空pYES2載體的酵母),試驗(yàn)結(jié)果表明:ThPrx1基因?qū)aCl、KCl、Na2CO3、CuSO4、CdCl2、高溫、低溫、山梨醇、甲基紫精等脅迫均具有抗性能

3、力。
　　 利用SMART技術(shù),構(gòu)建了以酵母菌株Y187為宿主、用于酵母雙雜交檉柳cDNA文庫(kù)。所獲得的文庫(kù)的插入長(zhǎng)度在750 bp到3500 bp之間。轉(zhuǎn)化效率為1.89×107cfu/3μgpGADT7-Rec,文庫(kù)滴度為2.13×107pfu/ml,重組率為80％。
　　 將ThPrx1基因構(gòu)建到酵母雙雜交載體(pGBKT7 DNA-BD)中,經(jīng)毒性和轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)表明,ThPrx1蛋白無(wú)自轉(zhuǎn)錄激活能力,其表達(dá)蛋白

4、對(duì)酵母無(wú)毒性,可以用于雙雜交分析。用pGBKT7-ThPrx1作為誘餌,篩選了檉柳酵母雙雜cDNA文庫(kù)。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將誘餌和文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H,經(jīng)TDO/X-α-Ga/AbA(Aureobasidin A)培養(yǎng)基篩選得到陽(yáng)性克隆通過(guò)進(jìn)一步的雙雜交篩選驗(yàn)證獲得了兩個(gè)與ThPrx1蛋白互作的蛋白,分別是油體鈣蛋白(calcium lipid binding protein)和與CONSTANS互作蛋白(CONSTANS inter