重組桿狀病毒介導的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征基因工程疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種能夠導致母豬嚴重繁殖障礙及仔豬呼道癥狀和高死亡率的病毒性傳染病。免疫接種一直是預防病毒性傳染病的最主要手段，但目前針對PRRS的商品化滅活苗和弱毒苗存在免疫效果不理想或不安全的缺陷，尤其是近年來，由于高致病性PRRSV毒株的出現(xiàn)，由經(jīng)典PRRSV毒株制備的疫苗更是難以誘導針對高致病性PRRSV的有效保護性免疫反應，因此急需研制針對高致病性PRRSV的新型疫苗

2、。
　　 SFV復制子載體是基于西門利克森林病毒的真核表達載體，它不僅具有自主復制功能，能夠高水平表達外源基因，而且具有誘導宿主細胞凋亡的特性。桿狀病毒是目前一種應用十分廣泛的載體，主要用于基因治療和疫苗開發(fā)等領域。研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒載體可以攜帶哺乳動物啟動子驅動的外源基因表達盒進入哺乳動物細胞，從而使外源基因得到高效及穩(wěn)定的表達。若經(jīng)過適當?shù)男揎椈蝾A處理，還可介導外源基因在哺乳動物體內(nèi)進行表達，而其自身基因組并不復制和表達。<

3、br>　　 基于桿狀病毒的高轉導效率及SFV復制子的自主復制和誘導細胞凋亡的優(yōu)勢，同時為了消除桿狀病毒的補體敏感性，本研究利用囊膜表面展示水泡性口炎病毒G蛋白的假型桿狀病毒載體，構建了基于SFV復制子的，共表達高致病性PRRSVWUH3株ORF3、ORF4、ORF5(修飾的ORF5)、ORF6四個結構蛋白基因的重組桿狀病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6，并對其免疫原性進行了評價。具體研究內(nèi)容如下：
　　 1.“

4、自殺性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的構建。
　　 擴增高致病性PRRSVWUH3株的ORF3、ORF4、ORF5（修飾的ORF5）、ORF6基因以及西門利克森林病毒的26s亞基因組啟動子，分別構建了由26s亞基因組啟動子驅動的ORF3、ORF4、ORF5(修飾的ORF5)、ORF6基因的表達盒，進一步插入“自殺性”DNA疫苗表達載體pSCA1，獲得共表達ORF3、ORF4、ORF5（修飾的ORF5

5、）、ORF6基因的“自殺性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6。
　　 2.重組桿狀病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的構建。
　　 用SpeI和Sph1分別雙酶切質粒pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6和載體pFastBac-VSV/G，將獲得的片段CMV/SFV-ORF3/4/5/6插入到載體pFastBac-VSV/G中，得到穿梭質粒pFastBac-VSV/G-

6、CMV/SFV-ORF3/4/5/6。將構建的穿梭質粒轉化DH10Bac感受態(tài)細胞，三抗篩選陽性重組子并提取重組Bacmid，經(jīng)脂質體介導轉染sf9昆蟲細胞，獲得共表達ORF3、ORF4、ORF5（修飾的ORF5）和ORF6基因的重組桿狀病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6。
　　 3.重組桿狀病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6在小鼠體內(nèi)誘發(fā)的保護性免疫反應。
　　 將構建的重組桿狀病毒BV

7、-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6以3種不同的劑量（109pfu/只，108pfu/只，107pfu/只）經(jīng)后腿肌肉注射免疫Balb/c小鼠，同時與共表達相同基因的“自殺性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6進行比較。結果表明構建的重組桿狀病毒能誘導更強的免疫反應，并呈明顯的劑量依賴性，其中109pfu免疫組所誘導的免疫反應最強，首免6周后針對GP5蛋白和全病毒的ELISA抗體滴度分別達到1:4480和1