水稻苗期葉色突變體的蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、葉色變異是高等植物中突變頻率較高且易于辨別的突變性狀,在理論研究和實際應用方面都具有重要的意義。其中的一些葉色變異型以其表型明顯可分辨的特點,可作為一種形態(tài)標記性狀在植物遺傳、育種研究中得以有效利用,在功能基因組學研究方面,它們已成為深入開展植物色素合成、葉綠體發(fā)育等相關基因功能研究的理想材料。
　　 本研究組于1996年從水稻花藥培養(yǎng)的白化苗中獲得能夠自然轉(zhuǎn)綠的植株,經(jīng)多代選擇培育成性狀穩(wěn)定的可自然轉(zhuǎn)綠型白化苗突變體,將之與光

2、溫敏不育系培矮64S雜交,從后代中獲得具有白苗復綠性狀的光溫敏不育株系白02S。本研究以白02S和培矮64S為材料,分別從葉色表型特征、葉綠體超微結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和mRNA表達水平等方面對該性狀進行較為系統(tǒng)的研究,以期部分闡明其白化復綠機理。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.白02S和培矮64S的形態(tài)學和超微結(jié)構(gòu)觀察表明,白02S苗期前三葉均為白色,第四葉及之后長出的葉片均為正常綠色,第四葉長出后,健在的白化葉有部分轉(zhuǎn)綠,其白化表型明顯

3、可辨期為30天以上。培矮64S作為白02S的對照,在整個苗期都顯示正常的綠色。利用透射電鏡對白02S轉(zhuǎn)綠前后兩個時期的葉綠體超微結(jié)構(gòu)進行觀察,白02S的白化葉葉綠體表現(xiàn)發(fā)育遲緩,沒有觀察到完整的葉綠體雙層膜及類囊體片層,四葉期復綠后,出現(xiàn)了完整的葉綠體結(jié)構(gòu),葉綠體數(shù)量較多,具有清晰的葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu),以及內(nèi)部相互連接的基粒類囊體,與對照培矮64S無差異。結(jié)果表明白化性狀產(chǎn)生的因為是葉綠體發(fā)育和葉綠素合成相關的基因發(fā)生改變,導致初期類囊體

4、發(fā)育受阻,而不是其它色素改變所致。
　　 2.提取白02S和培矮64S的二、三葉期的葉片蛋白,經(jīng)2D-PAGE分離后,構(gòu)建了白02S突變體轉(zhuǎn)綠前后的差異蛋白質(zhì)的表達譜；通過比較蛋白質(zhì)表達譜之間的差異蛋白,再經(jīng)MALDI-TOF/MS分析和數(shù)據(jù)庫檢索鑒定發(fā)現(xiàn)白02S突變體的白化期有62個差異蛋白質(zhì)點,其中44個上調(diào)蛋白,18個下調(diào)蛋白；對差異蛋白進行了功能分類和生物信息學分析發(fā)現(xiàn),除了部分未知蛋白質(zhì),大部分已知蛋白參與了信號轉(zhuǎn)導、

5、植物的光反應、滲透脅迫調(diào)節(jié)、糖酵解-三羧酸循環(huán)--e-傳遞系統(tǒng)(EMP-TCA-ETS)代謝途徑、光合作用、光呼吸和光合磷酸化等的生理過程。這表明白化過程是一個多種信號和代謝途徑的調(diào)節(jié)的結(jié)果。
　　 3.以白02S突變體轉(zhuǎn)綠前后的兩個時期為實驗材料,通過比較分析轉(zhuǎn)綠前后的基因表達圖譜的變化,得到差異表達2倍以上的探針組5167個,形成了白02S突變體轉(zhuǎn)綠前后的差異基因表達譜,這為研究葉色突變的發(fā)生機制奠定了基礎；對差異基因進行功

6、能鑒定和分類分析后顯示差異基因涉及到多種代謝途徑以及信號轉(zhuǎn)導,與對白02S蛋白質(zhì)組學研究的結(jié)果相一致。
　　 4.將基因芯片表達譜數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行綜合分析,結(jié)果顯示:在白02S突變體白化期的18個下調(diào)蛋白中與芯片數(shù)據(jù)沒有overlap基因,而上調(diào)的44個蛋白中與芯片數(shù)據(jù)結(jié)合分析找到5個overlap基因,它們分別是2個未知蛋白,一個葉綠體核糖核蛋白CP29A、一個蛋白酶體a亞基和烯醇酶；在這五個蛋白點中,四個蛋白質(zhì)的表達

7、與對應的mRNA表達趨勢一致,均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,只有No.37蛋白質(zhì)表達和對應的mRNA表達呈相反的趨勢。
　　 5.應用實時定量PCR技術對白02突變體的轉(zhuǎn)綠前后兩個時期的RNA表達水平進行了比較研究,旨在對差異蛋白質(zhì)表達譜、差異基因表達譜以及蛋白質(zhì)表達譜和基因芯片表達譜綜合分析結(jié)果的驗證。蛋白質(zhì)表達與實時PCR驗證結(jié)果的一致性、基因芯片分析結(jié)果與qRealtime-PCR分析結(jié)果一致性均在80％以上。
　　 本研究為研