青海省部分地區(qū)冬蟲夏草遺傳多樣性RAPD分析.pdf

1、冬蟲夏草為傳統(tǒng)名貴中藥材。冬蟲夏草資源在青海省的分布區(qū)主要是在青南高原的玉樹、果洛二州，在青海中部也有分布。本論文采用RAPD分子標記技術對青海省不同產(chǎn)地的20份冬蟲夏草樣品進行了多態(tài)性分析和聚類比較，從而為我省冬蟲夏草資源在遺傳多樣性保護，分類研究，遺傳圖譜構建等方面積累了資料，為其他藥用物種進行RAPD實驗提供參考和借鑒。通過研究，取得了以下進展：
　　 1.對分別用SDS法、改良CTAB法兩種方法提取的冬蟲夏草基因組DNA

2、，進行電泳檢測和紫外分光光度的檢測。結果表明兩種方法均可獲得完整的冬蟲夏草基因組DNA，但是改良CTAB法提取的冬蟲夏草DNA質量較好，電泳檢測的譜帶清晰穩(wěn)定，無降解。同時采用改良CTAB法提取的DNA的OD260/OD280值相對較好，間于1.6-2.0之間，說明DNA質量較好。因此，通過以上2種方法的對比可以選擇了改良的CTAB法進行冬蟲夏草DNA基因組的提取。
　　 2.實驗對PCR反應體系中5個重要因子進行了正交試驗，篩

3、選出最優(yōu)的反應體系，并在此最優(yōu)體系的基礎上，分別對退火溫度、擴增循環(huán)數(shù)進行了單因素試驗，得到了RAPD反應合理的熱力學程序，確定了一套優(yōu)化的冬蟲夏草RAPD反應體系和PCR擴增條件。通過正交試驗得到了冬蟲夏草RAPD-PCR的最佳擴增體系為：20μl總反應體系中包含，35 ng模板DNA，2.0 U Taq酶，0.4μmol/L引物，0.2 mmol/LdNTPs，1.5 mmol/L Mg2+。其熱循環(huán)程序為；95℃預變性3 min之

4、后進行40次循環(huán)，94℃變性60 S，37℃退火1 min，72℃延伸2 min。最后72℃延伸5 min，保存于4℃。
　　 3.用40個隨機引物對20份冬蟲夏草樣品進行了RAPD分析，成功地篩選出了9個適合于冬蟲夏草RAPD分析的隨機引物，這些引物可以擴增出豐富清晰的條帶。這9個引物進行PCR擴增后，共檢測到65個位點，平均每條引物檢測到7.2個位點，其中呈多態(tài)性位點57個，平均多態(tài)性條帶數(shù)為6.3條，多態(tài)性位點比率P為87

5、.69％，9個引物的多態(tài)位點比率從75％-100％不等。
　　 4.根據(jù)隨機引物對20個冬蟲夏草樣品的擴增結果構建0/1矩陣，在NTSYS軟件上計算出各品種間的相似系數(shù)，品種間的相似系數(shù)決定了品種間的親緣關系，相似系數(shù)越大，親緣關系越近。20個冬蟲夏草樣品間的相似系數(shù)介于0.1818-0.9876之間。其中樣品18和20的相似系數(shù)最大為0.9876，表明兩者親緣關系最近。聚類分析結果表明：五個樣地的20個樣品，每個樣地的樣品均聚