羊補(bǔ)體分子C3d基因的克隆及羊包蟲病基因工程亞單位疫苗的研制.pdf

1、棘球蚴病(Echinococcosis granulosis)又稱包蟲病(Hydatidosisl)，是由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)的中絳期幼蟲——棘球蚴(Echinococcus)寄生于哺乳動物臟器內(nèi)所引起的一種人獸共患的流行性寄生蟲病。免疫預(yù)防接種是控制包蟲病行之有效的方法，因此研制高效、實(shí)用的新型羊包蟲病基因工程亞單位疫苗一直是國內(nèi)外科學(xué)家多年來共同追求的目標(biāo)。 目前，含有重組蛋白EG9

2、5的羊包蟲病基因工程亞單位疫苗取得了突破性的進(jìn)展，已經(jīng)成為預(yù)防包蟲病最有前景的疫苗。但是由于重組蛋白EG95表達(dá)量偏低且不可溶，上述因素都制約了該疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。近來眾多研究表明，作為補(bǔ)體分子C3一個裂解片段的C3d，可大幅度提高與之融合抗原的免疫原性，是一種引起研究人員廣泛關(guān)注的新型分子佐劑。 基于上述背景，本研究克隆了羊補(bǔ)體分子C3d基因并對羊包蟲病基因工程亞單位疫苗進(jìn)行了的改造。一方面提高重組蛋白EG95的可溶性，并

3、通過串聯(lián)表達(dá)提高其表達(dá)量；另一方面，構(gòu)建含三拷貝羊C3d與EG95的重組質(zhì)粒，并表達(dá)融合蛋白，以圖提高重組蛋白EG95的免疫原性。 主要研究工作如下： 1.提高重組蛋白EG95的可溶性及其串聯(lián)表達(dá)通過軟件分析，選取EG95基因序列中一段長為350bp、編碼高度親水的優(yōu)勢表位的序列(EG95s)，構(gòu)建了含該基因序列的原核表達(dá)載體，并進(jìn)一步構(gòu)建了含2拷貝、3拷貝該序列的原核表達(dá)載體，表達(dá)了重組蛋白GST-EG95s，GST-

4、2EG95s，GST-3EG95s。經(jīng)western-blotting鑒定證實(shí)上述重組蛋白均為正確表達(dá)。 2.羊補(bǔ)體分子C3d基因的克隆和序列分析根據(jù)已發(fā)表的羊補(bǔ)體分子C3d基因，設(shè)計(jì)引物，從羊肝臟組織提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增出羊C3d基因，序列測定表明所擴(kuò)增的基因片斷與已公布的羊C3d基因核苷酸序列同源性為99.1％，氨基酸序列完全一致。軟件分析表明羊羊C3d基因與大多數(shù)哺乳動物C3d基因核苷酸序列同源性為80％左右

5、，其中與牛C3d基因同源性為95％，揭示羊和牛在進(jìn)化樹上最為接近。 3.羊C3d基因與EG95s基因的串聯(lián)及原核表達(dá)為檢驗(yàn)羊C3d對EG95抗原的免疫增強(qiáng)作用，將EG95s基因與3拷貝羊C3d基因串聯(lián)，在每個串聯(lián)基因間加入Linker鏈，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-EG95s-3C3d，并表達(dá)了重組蛋白GST-EG95s-3C3d。SDS-PAGE電泳和免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)該重組蛋白與預(yù)期的分子量一致，具有EG95蛋白的免