栽培大豆和灘涂野大豆及其雜交后代CLC1基因鑒定和功能的初步研究.pdf

1、本文以栽培大豆N23674品種（耐鹽性較弱）和灘涂野生大豆BB52種群（耐鹽性較強(qiáng)）及其經(jīng)逐代耐鹽性篩選的雜交后代4076、4013（F5）幼苗為材料，目的在于闡明氯離子通道基因（CLC1）在利用灘涂野大豆提高栽培大豆耐鹽性過(guò)程中的作用及其分子機(jī)理，為選育適合在我國(guó)沿海灘涂生態(tài)環(huán)境下種植的耐鹽、具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀和品質(zhì)的栽培大豆新品系或新品種提供理論依據(jù)。
　　 用150 mmol·L-1 NaCl（1/2 Hoagland溶液配

2、制）處理栽培大豆N23674和野生大豆BB52及其雜交后代4076、4013（F5）株系0、1、4、8、12 h。以已公布的GmCEC1（GenBank注冊(cè)號(hào)：AY972079）cDNA序列為模板，根據(jù)不同試驗(yàn)?zāi)康睦肞rimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物：設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物，通過(guò)半定量RT-PCR方法比較鹽脅迫下不同大豆材料CLC1 mRNA的豐度；設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，經(jīng)RT-PCR克隆獲得不同大豆材料CLC1基因完整開(kāi)放閱讀框（

3、ORF），并進(jìn)行序列分析。在已獲得的CLC1基因完整ORF兩端引入AscⅠ、HpaⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體PS1aGFP-8-CLC1，用基因槍法進(jìn)行CLC1蛋白亞細(xì)胞定位。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a（+）-CLC1，在已獲得的CLC1基因完整ORF兩端引入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。
　　 半定量RT-PCR研究結(jié)果表明，在鹽脅迫12 h的過(guò)程中，BB52根中CL

4、C1 mRNA的豐度表現(xiàn)持續(xù)快速積累的特點(diǎn)，葉片中的響應(yīng)雖較遲緩，但在12 h時(shí)也積累到較高水平。在N23674根中CLC1 mRNA也表現(xiàn)出積累趨勢(shì)，但響應(yīng)時(shí)間較BB52推遲（鹽處理8 h以后），豐度也略低；葉中也表現(xiàn)一定程度的增強(qiáng)，但在整個(gè)鹽處理過(guò)程中表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定。兩后代4013和4076株系的變化則介于兩親本之間。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在供試大豆材料中擴(kuò)增到的CLC1基因cDNA全序列與已報(bào)道的GmCLC1的cDNA全序列進(jìn)行比

5、對(duì)的結(jié)果表明，供試3材料的ORF序列完全一致，卻都與已報(bào)道的GmCLC1的ORF序列存在3個(gè)堿基的差異，進(jìn)而造成2處氨基酸發(fā)生改變[R（精氨酸）變?yōu)長(zhǎng)（亮氨酸），前者是堿性氧基酸，而后者是酸性氧基酸]。
　　 基因槍轟擊后通過(guò)報(bào)告基因GFP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)帶有目的基因的GFP信號(hào)定位于洋蔥表皮細(xì)胞的液泡膜上，表明CLC1是一個(gè)定位于液泡膜上的蛋白質(zhì)。
　　 pET30a（+）-CLC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)后