犬瘟熱病毒的分離及主要蛋白基因序列分析.pdf

1、犬瘟熱(Caninedistemper,CD)的病原是犬瘟熱病毒(CaninedistempervirusCDV)，該病以雙相熱、急性鼻卡他、結(jié)膜炎、嚴(yán)重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為特征。發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)犬業(yè)和毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)帶來(lái)極大的危害，加強(qiáng)本病的預(yù)防免疫極為重要，因此采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程疫苗有重要意義。本文成功分離了一株犬瘟熱病毒并進(jìn)行了主要蛋白基因序列分析，為構(gòu)建新型基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 本文通過(guò)對(duì)從20

2、09-2011年山東部分地區(qū)疑似犬瘟熱的犬、貉、貂和狐貍臨床癥狀和病理變化進(jìn)行研究，探討犬瘟熱的臨床癥狀和病變特點(diǎn)，并進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn)近幾年患病犬、貉、貂和狐貍臨床癥狀出現(xiàn)新的變化，足墊的角質(zhì)化、皮膚病變現(xiàn)象逐漸減少，后肢癱瘓癥狀增多。廣泛性出血，缺乏特征性病變。發(fā)病急、死亡率高。一年四季都有發(fā)生。
　　 采用Vero細(xì)胞從臨床疑似患犬瘟熱的犬組織病料中分離出一株病毒，通過(guò)觀察細(xì)胞病變，間接免疫熒光，提取細(xì)胞培養(yǎng)物RN

3、A并擴(kuò)增克隆分析N蛋白基因部分序列進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明:該毒株接種于Vero細(xì)胞后，出現(xiàn)了典型的細(xì)胞病變;間接免疫熒光試驗(yàn)表明接種病毒的BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)特異性的亮綠色熒光，而正常細(xì)胞則未見(jiàn)綠色熒光;對(duì)接種病料后的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物提取總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到了287bp的目的片段;序列分析表明該分離株與犬瘟熱病毒弱毒(Onderstepoort、CDV3、recombinantSnyderHill等)的同源性較低為95.8

4、％-97.2％，與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(A75/17和2544/Han95)以及野毒株(xJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性較高為97.6％-99.3％,證明該毒株為犬瘟熱病毒野毒株，命名為SD10。
　　 根據(jù)Genbank上已發(fā)表犬瘟熱病毒Onderstepoort(AF305419)株設(shè)計(jì)引物，參考有關(guān)文獻(xiàn)合成9對(duì)引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從CDV分離株SD10株的細(xì)胞毒中成功擴(kuò)增出了9段cDNA，將這9段cDNA與pGE

5、M-Teasy載體連接并進(jìn)行克隆、測(cè)序，測(cè)得的序列經(jīng)過(guò)拼接得到CDV核衣殼蛋白基因N、磷蛋白基因P、基質(zhì)膜蛋白基因M、融合蛋白基因F、血凝素蛋白基因H、大蛋白基因L的全基因序列。將分離株SD10株與22株Genbank上發(fā)表的CDV全基因組參考毒株的6個(gè)蛋白全基因核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比較分析。分析表明分離株SD10株與疫苗株Onderstepoort(OP)和CDV3親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，屬于強(qiáng)毒株，與中國(guó)分離株HLJ1-06、HIJ