RNAi抑制Smad4基因表達(dá)對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、Smads蛋白家族是近年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白，在轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor， TGF-β）超家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有重要的作用。Smad4作為Smad蛋白家族重要成員之一，是哺乳類中發(fā)現(xiàn)的唯一一種Co-Smad，被認(rèn)為是TGF-β各成員信號傳遞必需的中心轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Smad4在TGF-β/Smad信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)缺失或者突變都會引起TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，從而對機(jī)

2、體組織或細(xì)胞產(chǎn)生重要影響。近年來研究發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢中存在Smad4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，TGF-β對卵泡的分化調(diào)節(jié)很有可能是通過Smad4信號途徑實(shí)現(xiàn)。
　　 本文利用RNAi技術(shù)沉默Smad4基因，探討其對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響。設(shè)計(jì)并合成靶向Smad4的小分子干擾RNA，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞，熒光定量PCR檢測Smad4 mRNA表達(dá)情況；MTT（四甲基偶氮唑鹽）比色法分析檢測細(xì)胞活性；原位末端核苷酸標(biāo)記法（TUNEL

3、）及Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；熒光定量PCR檢測Bcl-2，Bax的mRNA表達(dá)水平。
　　 1 Smad4-siRNA轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞及其效率檢測
　　 根據(jù)豬Smad4基因序列設(shè)計(jì)小分子RNA，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞。熒光定量PCR檢測Smad4 mRNA表達(dá)水平，Smad4-siRNA轉(zhuǎn)染濃度為8pmoL，作用36h時，Smad4-siRNA抑制效果最好，siRNA實(shí)驗(yàn)組較空白

4、對照組下降84％(p＜0.01).利用MTT比色法檢測干擾后顆粒細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，siRNA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性(0.27)顯著低于對照組(0.31)（p＜0.05），說明Smad4-siRNA轉(zhuǎn)染對卵巢顆粒細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，推測RNAi抑制Smad4基因表達(dá)可能引起豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。
　　 2 RNAi抑制Smad4表達(dá)對顆粒細(xì)胞凋亡的影響
　　 采用原位末端核苷酸標(biāo)記法(TUNEL)和Annexin V/PI

5、流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡情況分析。結(jié)果顯示，siRNA實(shí)驗(yàn)組較對照組凋亡細(xì)胞明顯增多，Smad4基因表達(dá)被抑制后，細(xì)胞凋亡率(22.1％)顯著高于對照組(17.0％)(p＜0.05)。表明沉默Smad4基因可促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。
　　 3 RNAi抑制Smad4表達(dá)對Bcl-2和Bax的影響
　　 采用熒光定量PCR法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2以及Bax在顆粒細(xì)胞中相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空白組相比，siRNA實(shí)驗(yàn)組