SacB基因在紫花苜蓿中的轉(zhuǎn)化和植株再生的研究及PCR擴增條件的確立.pdf

1、本研究以三個苜蓿品種（和田苜蓿、甘農(nóng)3號和隴東苜蓿）為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行SacB基因在苜蓿中轉(zhuǎn)化的研究，并探索了轉(zhuǎn)化植株再生條件及其再生過程中的褐化因素，篩選出卡那霉素抗性植株。進一步對轉(zhuǎn)化組織進行了PCR檢測，優(yōu)化了PCR檢測條件，確立了適宜的PCR擴增條件。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.建立了苜蓿三個品種基因轉(zhuǎn)化體系。
　　 以和田苜蓿、甘農(nóng)3號和隴東苜蓿的下胚軸為外植體，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為轉(zhuǎn)化方法，

2、進行了SacB基因的轉(zhuǎn)化。系統(tǒng)研究了Kan對苜蓿組織生長的影響、Kan篩選時期和篩選濃度、菌液濃度、侵染時間及預(yù)培養(yǎng)時間。結(jié)果表明：Kan對苜蓿種子萌發(fā)的影響不顯著：愈傷分化階段是最適宜的篩選階段，和田苜蓿、甘農(nóng)3號、隴東苜蓿的選擇壓分別為80mg/L、60mgL、60mg/L。生根階段，3個品種的Kan選擇壓分別為100mg/L、80mg/L、80mg/L。甘農(nóng)3號、和田苜蓿、隴東苜蓿適宜的菌液的OD值分別為0.6、0.5和0.4。紫

3、花苜蓿轉(zhuǎn)化前不需要進行預(yù)培養(yǎng)，適宜的侵染時間為10min。
　　 2.分析探討了轉(zhuǎn)化組織在冬夏兩季再生過程中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象，提出了相應(yīng)的解決的辦法。
　　 培養(yǎng)物的褐化程度具有季節(jié)性差異。2，4-D的最佳作用天數(shù)為15-20d，愈傷誘導(dǎo)、分化再生和生根階段蔗糖的最佳濃度分別為30g/L、20g/L和10g/L?；蛐陀绊懪囵B(yǎng)物的褐化程度，褐化程度順序為隴東苜蓿>和田苜蓿>甘農(nóng)3號。培養(yǎng)溫度冬季以恒溫25℃為宜，夏季以白天

4、23℃+黑夜21℃為宜。光照以3000Lux左右為宜。NAA的濃度在夏季應(yīng)較冬季適當(dāng)降低，IBA誘導(dǎo)生根適宜在冬季使用，生根率高，且褐化少。
　　 3.優(yōu)化了PCR反應(yīng)條件，對轉(zhuǎn)化組織進行了PCR檢測。
　　 對轉(zhuǎn)化體進行PCR檢測，結(jié)果表明：最佳引物為a組引物；最佳退火溫度為52℃：25ul的反應(yīng)體系中，dNTP、Mg2+、TaqDNA的最佳用量分別是2.0ul、2.5ul和0.4ul。在選取的50個抗性愈傷中，僅有1