日本腦炎病毒E蛋白多表位疫苗的設(shè)計(jì)及其在小鼠模型上的免疫效力評(píng)價(jià).pdf

1、日本腦炎病毒（簡稱乙腦）屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種以蚊蟲為媒介傳播的人畜共患的病毒性疾病。對(duì)人類危害巨大，是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一，對(duì)豬可引起繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬是JEV的中間宿主，帶毒豬是本病的主要傳染源。因此，控制豬的乙腦不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)而且對(duì)人類健康都具有十分重要的意義。
　　 目前用于豬的乙腦疫苗包括弱毒苗和滅活苗，但是有關(guān)它們的安全性，生產(chǎn)和使用費(fèi)用等問題越來越突出。WHO正在呼吁改善和研

2、制新型乙腦疫苗，乙腦病毒的E蛋白與病毒和細(xì)胞受體結(jié)合，膜融合有關(guān)，也是引起中和抗體及宿主保護(hù)的主要免疫蛋白。
　　 表位（epitope）是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱抗原決定簇（antigenic determinant）。它是T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）和B細(xì)胞抗原受體（B cell receptor，BCR）與抗體特異結(jié)合的基本單位。在免疫應(yīng)答中，TCR和BCR所識(shí)別的抗原表位不

3、同，分別被稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。作為理想的免疫原，抗原分子中應(yīng)同時(shí)包含目的抗原B細(xì)胞表位和自身或外源T細(xì)胞表位，才能誘導(dǎo)出高度特異性的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，從體液免疫和細(xì)胞免疫水平起到預(yù)防或治療作用，賦予較廣泛的保護(hù)性。目前關(guān)于表位疫苗的設(shè)計(jì)策略取得了較大的研究進(jìn)展，因此表位疫苗成為近年來病毒新型疫苗研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究利用基因重組技術(shù)，把日本腦炎病毒E蛋白上6個(gè)主要的B細(xì)胞表位，一個(gè)CTL表位和一個(gè)Th表位基因串聯(lián)起

4、來，構(gòu)建入原核表達(dá)載體，在E.coliBL21中表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白純化后免疫小鼠研究其免疫原性及保護(hù)效力，希望為研制具有高免疫原性的乙腦病毒多表位疫苗提供依據(jù)。具體的研究內(nèi)容如下：
　　 1、日本腦炎病毒E蛋白多表位基因的設(shè)計(jì)及在大腸桿菌中的融合表達(dá)
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及多表位疫苗的構(gòu)建策略，本文選擇了E蛋白上6個(gè)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的B細(xì)胞表位，氨基酸殘基分別位于75-92，149-163，258-285，356-

5、362，373-399，397-403。以及一個(gè)CTL表位和一個(gè)Th表位，氨基酸殘基分別位于60-68和436-445。各表位間用甘氨酸和絲氨酸分開，使各表位相對(duì)獨(dú)立并有利于抗原的遞呈。根據(jù)大腸桿菌偏嗜性密碼子原則，設(shè)計(jì)合成10條引物，采用重疊延伸：PCR（SOE）合成JEV E蛋白的多表位基因（命名為MEP），將其克隆到pMD18-T載體，經(jīng)測(cè)序分析正確后，用EcoRI和XhoI雙酶切連接到表達(dá)載體pET-28a（+）中，構(gòu)建出重組表

6、達(dá)質(zhì)粒pET-MEP。將其轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和超聲波裂解菌體后，運(yùn)用SDS-PAGE進(jìn)行可溶性分析，然后以His·Bind螯合層析柱純化融合蛋白（命名為rMEP），利用WesternBlotting對(duì)該融合蛋白進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：重組融合蛋白rMEP以包涵體的形式獲得了高效表達(dá)。通過His·Bind螯合層析柱純化后的融合蛋白rMEP，經(jīng)SDS-PAGE和薄層掃描分析獲得了較好的純化，其純度達(dá)到了97.2％

7、；且通過Western Blotting鑒定其具有良好的抗原性。
　　 2、日本腦炎病毒E蛋白多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性和保護(hù)效力研究4～6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。將rMEP、EDⅢ蛋白、E蛋白和滅活苗分別以腹腔接種的方式給小鼠進(jìn)行3次免疫，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，用PBS免疫。然后通過測(cè)定抗體水平、抗體亞型、中和抗體、細(xì)胞因子（IL-4，IL-2和IFN-γ）和CTL，并做了攻毒保護(hù)試驗(yàn)來衡量rMEP的免

8、疫效果。結(jié)果表明，rMEP既能誘導(dǎo)體液免疫又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，且體液免疫和細(xì)胞免疫的水平均比EDⅢ蛋白和E蛋白高。抗體亞型分析結(jié)果表明，rMEP既能誘導(dǎo)IgG1的分泌又能誘導(dǎo)IgG2的分泌，但以IgG1為主；同時(shí)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明rMEP主要誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子（IL-4）的產(chǎn)生，因此說明rMEP主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rMEP與滅活苗一樣都能保護(hù)小鼠免受致死量的乙腦病毒的感染。
　　 綜上所述，構(gòu)建