小鼠法和高效液相色譜法測(cè)定野生河鲀不同組織內(nèi)河豚毒素的含量.pdf

1、從我國(guó)丹東、青島和南通采集了四種野生河豚魚(yú)樣本，分別是紅鰭東方豚、黃鰭東方豚、假睛東方豚和菊黃東方豚，用小鼠單位法和高效液相法檢測(cè)不同組織內(nèi)河豚毒素(Tetrodotoxin簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)TX)的含量。 小鼠法是最早建立的河豚毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，由上世紀(jì)40年代美國(guó)學(xué)者建立。原理是根據(jù)小鼠死亡時(shí)間倒數(shù)與單位體重接受毒素量成正比關(guān)系，建立小鼠死亡時(shí)間倒數(shù)－河豚毒素劑量曲線，通過(guò)相應(yīng)系數(shù)換算便可查知樣品毒素含量的方法。目前這一方法仍是日本官方檢

2、測(cè)河豚毒素的方法。此法測(cè)得的毒力用小鼠單位(mollse unit，MU)表示，1MU是指30分鐘殺死一只20克雄性ddy小鼠的毒素量(1MU=0.22μg河豚毒素)。小鼠法檢測(cè)結(jié)果是，河豚魚(yú)體不同部位檢測(cè)到的河豚毒素的含量是不同的，卵巢的毒力最大，其次為肝臟，皮膚的毒力略大于肌肉，其中皮膚和肌肉暫時(shí)定為無(wú)毒，但由于受采樣季節(jié)及捕獲的河豚魚(yú)種類及數(shù)量的限制，部分統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)仍需進(jìn)一步完善，同一地域同一種類的河豚魚(yú)在不同的年份含毒量及有毒率也

3、存在很大差異。小鼠法檢測(cè)平均回收率為86.35％－88.03％，肝臟的毒力范圍是0－171.20 MU/g，卵巢的毒力范圍是0－739.68 MU/g，皮膚和肌肉的毒力范圍是1－10 MU/g。 對(duì)TTX的高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)，樣品的前處理是關(guān)鍵，主要涉及提取和純化過(guò)程中的回收率和除雜效果。以往的文獻(xiàn)報(bào)道中，河豚魚(yú)組織中的TTX經(jīng)醋酸溶液提取后，首先以吸附性很強(qiáng)的物質(zhì)來(lái)除去提取液中的雜質(zhì)，雖然這些物質(zhì)具有較好的除雜質(zhì)效

4、果，但它們對(duì)河豚毒素的吸附能力也很強(qiáng)，而且不易洗脫和回收，操作繁雜，不可避免的造成毒素的回收率偏低。然后過(guò)截留分子量為1000的超濾膜或Bio－Gel P－2分子篩層析柱去除大分子物質(zhì)，上陽(yáng)離子交換樹(shù)脂2－3遍吸附河豚毒素和去除氨基酸，酸洗脫液冷凍干燥。最終樣品是得到很好的凈化，但回收率過(guò)低，較難用于HPLC法的TTX定量分析。在本實(shí)驗(yàn)中使用活化的SPE HLB固相萃取小柱柱替代繁瑣低效的純化過(guò)程，小柱經(jīng)甲醇、水活化后，經(jīng)HPLC法驗(yàn)證

5、，TTX峰與周?chē)s質(zhì)分離良好，基質(zhì)大大減少，回收率亦令人滿意，達(dá)到了預(yù)期純化效果。 本次實(shí)驗(yàn)以離子對(duì)磷酸緩沖鹽為流動(dòng)相，聯(lián)合PDA檢測(cè)的反相高效液相色譜方法定量分析河豚毒素。方法：WATERS600E液相系統(tǒng)，PDA996二極管矩陣檢測(cè)器；色譜柱Hypersil ODSC18(i.d4.6×200mm5μm，大連依利特公司)：流動(dòng)相0.05mol/LNaH2PO4:0.05mol/LNa2HPO4=1:1(V/V)，庚烷磺酸鈉離