苯并[α]芘對(duì)櫛孔扇貝生殖毒性效應(yīng)的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，簡(jiǎn)稱(chēng)PAHs)是持久性有機(jī)污染物的主要代表，具有內(nèi)分泌干擾特性。近年來(lái)，隨著海上石油和輪船運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展以及工業(yè)、生活污水的大量排放，海洋環(huán)境中PAHs的污染日益加重。但有關(guān)PAHs對(duì)污染物的指示生物一雙殼貝類(lèi)生殖毒性的研究較少，國(guó)內(nèi)更未見(jiàn)報(bào)道。本論文以苯并[α]芘(B[α]P)作為PAHs的代表，研究了B[α]P對(duì)櫛孔扇貝性腺中激素水平、雌激素受體和卵黃蛋白原的

2、基因表達(dá)以及顯微結(jié)構(gòu)的影響，并初步探討了B[α］P對(duì)櫛孔扇貝的生殖毒性機(jī)制，得到了如下結(jié)果： 1.苯并[α]芘對(duì)櫛孔扇貝性腺中睪酮和雌二醇含量的影響 激素對(duì)于生物體的生長(zhǎng)發(fā)育生殖等過(guò)程具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝曝污于不同濃度(0.1μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L)的B[α]P，分別于6d和15d取樣，通過(guò)放射性試劑盒測(cè)定了櫛孔扇貝精巢和卵巢中睪酮和雌二醇含量的變化。結(jié)果表明，B[α]P能夠降低櫛孔扇貝性腺中

3、睪酮和雌二醇的含量，除15d時(shí)，2.5μg/L B[α]P能夠顯著降低卵巢中的雌二醇含量(P<0.05)外，其它處理組在6d和15d時(shí)對(duì)睪酮和雌二醇含量的影響不顯著(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)表明，B[α]P能夠通過(guò)降低櫛孔扇貝性腺中睪酮和雌二醇的含量而發(fā)揮內(nèi)分泌干擾作用。 2.櫛孔扇貝雌激素受體(ER)基因的克隆與序列分析 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)相近物種ER氨基酸序列的同源性比對(duì)，根據(jù)保守氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物，利用RT-PCR以及R

4、ACE技術(shù)成功克隆了櫛孔扇貝ER的完整cDNA序列。將櫛孔扇貝的ER與其它物種的ER進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，ER具有高度保守性，尤其是在DNA結(jié)合區(qū)(DBD)，櫛孔扇貝ER的DBD與牡蠣ER的DBD相似性為98％，與人ERα的DBD相似性為87％，而所選物種間配體結(jié)合區(qū)(LBD)的保守性相對(duì)較低。通過(guò)ER的組織特異性研究發(fā)現(xiàn)，ER在所選組織中均有表達(dá)，且在雌性性腺中表達(dá)量較高。 3.櫛孔扇貝卵黃蛋白原(VTG)基因的克隆與序列分析

5、 根據(jù)NCBI上收錄的相近物種的VTG氨基酸序列在線(xiàn)設(shè)計(jì)兼并引物，通過(guò)RT-PCR以及RACE技術(shù)成功克隆了櫛孔扇貝VTG的部分cDNA序列。將櫛孔扇貝的VTG與其他物種的VTG進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝的VTG與同一科物種的VTG具有較高的相似性(78％-89％)，與同一目物種的VTG具有36％-43％的相似性，而與其它無(wú)脊椎動(dòng)物以及卵生脊椎動(dòng)物VTG的相似性較低，只有21％-33％。通過(guò)VTG的組織特異性研究發(fā)現(xiàn)，VTG只在

6、櫛孔扇貝雌性性腺中表達(dá)，說(shuō)明VTG在櫛孔扇貝中也是雌性特異的。 4.苯并[α]芘對(duì)櫛孔扇貝性腺中ER和VTG基因表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝曝污于不同濃度(0.1μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L)的B[α]P，分別于1d，3d，6d，10d，15d取樣，通過(guò)半定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定了櫛孔扇貝性腺中ER和VTG表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，2.5μg/L B[α]P處理15d時(shí)能夠顯著降低櫛孔扇貝卵巢中ER和VTG的基

7、因表達(dá)量(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)6d時(shí)，各處理組櫛孔扇貝卵巢中ER和VTG的基因表達(dá)量均略微高于對(duì)照組水平(P>0.05)，隨后又逐漸降低；實(shí)驗(yàn)期間，在櫛孔扇貝精巢中未檢測(cè)到VTG的表達(dá)且各處理組ER的基因表達(dá)量與對(duì)照組水平無(wú)顯著差異。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明B[α]P對(duì)櫛孔扇貝最終表現(xiàn)出抗雌激素效應(yīng)，能夠通過(guò)影響雌激素應(yīng)答基因的表達(dá)而造成生殖毒性。 5.苯并[α］芘對(duì)櫛孔扇貝性腺顯微結(jié)構(gòu)的影響 性腺的質(zhì)量是繁殖成敗的關(guān)鍵。，本實(shí)驗(yàn)將