藺草再生與轉化體系的建立及其離體誘變種質的創(chuàng)新.pdf

1、藺草是一種重要的經濟作物，但是到目前為止還沒有關于該植物種子誘導愈傷組織、愈傷擴繁及其植株再生方面的報道。鑒于藺草植物的重要性，通過轉基因和離體誘交獲得遺傳變異和品質改良的藺革新種質資源。進行這些研究的第一步就是要建立一個高效的組織培養(yǎng)體系。 我們主要研究不同植物生長調節(jié)劑的組合以及培養(yǎng)基更新對5種藺草品種植株再生的影響。在MS培養(yǎng)基中添加6-卞基腺嘌呤(BA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)對愈傷擴繁、植株再生和植株擴繁具

2、有明顯的促進作用。在鄞藺1號、農林4號、崗山、太草和臺灣綠草中，添加0.5mgL-1BA后，最高的愈傷誘導率分別達到80.95、90.48、75.40、70.83和83.33％。不同激素組合和連續(xù)接種(培養(yǎng)基更新)對胚性愈傷誘導和植株再生至關重要。實驗結果表明MS培養(yǎng)基中添加0.1mgL-1BA和2mgl-12，4-D對所有品種的藺草愈傷擴繁最好。植株再生需要分兩步，主要是進行培養(yǎng)基的更新和激素的平衡。通過把胚性愈傷組織從再生培養(yǎng)基I[

3、MS+0.5mgL-1BA+1.0mgL-1KT]轉移到再生培養(yǎng)基II[MS+0.5mgL-1BA+1.0mgL-1KT+3.0mgL-1IAA]后得到超過70％以上的再生植株。研究結果證實了生長素(IAA)與細胞分裂素(BA和KT)比例的重要性。在植株擴繁實驗中，1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5mgL-1BA后，農林4號和太草分別得到最高的植株存活率和擴增倍數(shù)(90.97％和5.40，94.23％和8.25)。建立的高效藺草植株再生體系可

4、進一步進行藺草的遺傳轉化和離體誘變等研究。 基于建立的高效藺草植株再生體系，進一步研究建立農桿菌介導藺草的高效轉化體系。農桿菌菌株EHA105內含有pKUB質粒帶有cryIA(b)，hph和gus基因，后兩者為篩選標記基因，分別編碼潮霉素磷酸轉移酶基因和β-葡萄糖苷酸酶基因。研究結果表明150μM的乙酰丁香酮在誘導和共培養(yǎng)實驗中均顯著地增加愈傷的GUS+率，當菌液濃度OD600達到0.4時使愈傷GUS+顯著提高。侵染時間為45-

5、60分鐘，共培養(yǎng)時間為4天，侵染時間為第12或16天，這樣的組合對遺傳轉化最有利，達到最高效率有9.56％。周GUS瞬間表達和潮霉素抗性來篩選陽性轉化體，這一轉化體系可以用來通過轉基因的方法得到目標性狀的植株，即通過種子得到胚性愈傷，在愈傷階段通過農桿菌介導等方法將目的基因轉入，然后得到轉基因的再生植株。通過這一再生體系再經過轉化條件的優(yōu)化，初步建立了農桿菌介導轉Bt基因的遺傳轉化體系。 基于藺草生態(tài)和經濟上的重要性，對主栽品種

6、鄞藺1號進行離體誘變處理，來研究甲基磺酸乙酯(EMS，0.1-1,0％處理6、12和24小時)和紫外線-C(UV-C，處理15、30、45和60分鐘)對藺草生理特征和超微結構的影響。將藺草植株莖桿基部切取做離體誘變實驗，經過EMS和UV-C處理后，將基段首先轉移到1/2MS培養(yǎng)基中，再轉移到營養(yǎng)土和珍珠巖混合的盆缽中生長和繁殖。植株的生長勢和生物量隨著誘交劑濃度的升高而顯著降低；在低誘變劑濃度時增加處理時間抗氧化酶活性明顯增加，但是，在

7、高處理濃度時，酶活性呈現(xiàn)下降的趨勢。生理和超微結構在突變體莖桿中也發(fā)生了明顯變化，尤其是葉綠素含量明顯降低。突變體的細胞和葉綠體大小均有所降低，而且在葉綠體中出現(xiàn)了大量的脂滴，類囊體膜結構發(fā)生了明顯的瓦解。EMS和UV-C處理后得到的在形態(tài)和超微結構上有所改變的突變體為該作物創(chuàng)造了遺傳多樣性，一些具有形態(tài)和生理上新穎性狀的突變體被篩選用于植物育種中，并可進一步用于遺傳研究。 對當?shù)刂饕奶A草栽培品種農林4號用抗有絲分裂的秋水仙堿

8、離體誘變處理，得到四倍體植株。植株莖桿基部在離體條件下用秋水仙堿(0、50、100和500mgL-1)分別處理6、12和24小時，然后將其轉移到1/2MS培養(yǎng)基中，再轉移到營養(yǎng)土和珍珠巖混合的盆缽中生長和繁殖。再生植株用流式細胞儀確定其倍性。四倍體植株在形態(tài)上比二倍體粗壯，生物量也多。進一步研究秋水仙堿對植物細胞和亞細胞水平上的作用，根據(jù)解剖和超微結構的分析可以看出四倍體植株在細胞和亞細胞水平上與對照間的差異。從葉片表皮細胞可以看出四倍

9、體氣孔明顯加大，但是氣孔密度顯著降低。而且，四倍體葉肉細胞更加緊湊，細胞間隙小，但是維管束尺寸明顯加大。有趣的是，四倍體葉綠素含量明顯降低，這可能是類囊體降解的結果。從亞細胞的超微圖研究可以看出，高濃度的秋水仙堿對葉綠體有破壞作用，導致類囊體膜系統(tǒng)瓦解。這些藺草四倍體植株可以用來進一步的遺傳研究。 目前研究中，由EMS和UV-C誘變后藺草DNA的損傷情況可以通過單細胞凝膠電泳的方法來進行評價(SCGE)。SCGE也叫作彗星檢測，