馬鏈球菌獸疫亞種融合蛋白亞單位疫苗的研制.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcusequissp.zooepidemicus，SEZ）能引起豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎及突發(fā)性死亡，是豬鏈球菌病的重要病原。
　　 類M蛋白（M-likeproteingene，SzP）是該菌一種重要的表面蛋白和毒力因子，具有調(diào)理素功能，能夠抵抗吞噬細(xì)胞對(duì)其的吞噬作用，是良好的保護(hù)性抗原；纖連蛋白結(jié)合蛋白（Fibronectin-bindingprotein，F(xiàn)NZ）和IgG結(jié)合蛋白（I

2、gG-bindingprotein，ZAG）在介導(dǎo)感染、抗調(diào)理吞噬以及模擬宿主自身成份逃避免疫的過(guò)程中起重大作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研制SzP、FNZ和ZAG融合亞單位疫苗，為豬鏈球菌病的防治提供新手段。
　　 1、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246菌株SzP、FNZ、ZAG部分片段的原核表達(dá)及免疫保護(hù)試驗(yàn)
　　 根據(jù)馬鏈球菌獸疫亞種（SEZ）SzP、FNZ和ZAG已發(fā)表的基因序列，通過(guò)DNAStar軟件分析，選取抗原性較好的片

3、段，各設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246的基因組為模板，擴(kuò)增SzP（527-1044bpGenBank登錄號(hào)：AY263781）、FNZ（1012-1519bpGenBank登錄號(hào)：DQ363208）、ZAG（134-664bpGenBank登錄號(hào)：U25852）。分別將擴(kuò)增的目的片段以正確的閱讀架定向克隆于pET32a中，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-szp、pET32a-fnz、pET32a-zag，然后將重

4、組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21中，在37℃1.0mM/LIPTG誘導(dǎo)下該片段獲得良好表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)SDS-PAGE分析表明融合蛋白位于菌體超聲裂解后的上清中。Westernblot分析顯示，表達(dá)的蛋白能與ATCC35246全菌制備的抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明SzP、FNZ和ZAG三種表達(dá)蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)率分別達(dá)到70％、60％、60％。
　　 2、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246菌株SzP、FNZ、ZAG基因融合載

5、體的構(gòu)建
　　 以常規(guī)分子克隆的方法將上述擴(kuò)增的SzP基因片段克隆至pET-32a，用重疊PCR將上述FNZ、ZAG基因片段串聯(lián)，與pET32a-szp連接，構(gòu)建pET32a-szp-fnz-zag重組表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)分子量約為75kD的融合蛋白。Westernblot分析顯示，表達(dá)的蛋白能與ATCC35246全菌制備的抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有良好的免疫反應(yīng)性。