家蠶bystin基因的分子特征和表達分析.pdf

1、Bystin最早在HT-H細胞中發(fā)現(xiàn)，是與Trophinin和Tastin結(jié)合的一種胞質(zhì)蛋白。Trophinin是膜內(nèi)在蛋白，通過同親性結(jié)合調(diào)節(jié)細胞粘連，這種細胞粘連需要Bystin和Tastin兩種胞質(zhì)蛋白的參與。troplurun和tastin基因只在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，而bystin基因，在真核生物中是高度保守的。目前研究認為bystin主要參與核糖體的生物發(fā)生、胚胎的植入與發(fā)育等生命活動過程，但家蠶bystin的功能至今未有報道。<

2、br>　　 本試驗從家蠶蛹cDNA文庫中擴增到家蠶bystin基因的完整開放閱讀框(ORF)，將其命名為Bmbys(Bomby.mor.bystin)。該ORF序列長128.bp，編碼427個氨基酸，預測分子量為49 kDa。我們將Bmbys基因克隆到原核表達載體pET-28a中，得到重組質(zhì)粒pET-28a-Bmbys，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒是正確的。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用終濃度為0.1m.IPTG低

3、溫誘導Bmbys蛋白的表達。得到的Bmbys蛋白以可溶性形式存在，故用超聲裂解菌體后離心所得的上清以親和層析的方法純化。以純化所得蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔，制備該蛋白的多克隆抗體，進一步用ELISA檢測抗體的效價可達到1:10000以上。利用得到的抗體通過免疫化學方法檢測Bmbys蛋白在家蠶發(fā)育過程中的表達情況，結(jié)果顯示在發(fā)育的蠶卵中Bmbys的表達具有動態(tài)的組織特異性。Wester.blotting結(jié)果顯示在蠶卵發(fā)育的早期Bmbys

4、高表達，中期表達量較低或不表達，晚期表達量達到最高。不同發(fā)育階段蠶卵的免疫組化試驗結(jié)果表明在蠶卵發(fā)育的早期Bmbys蛋白主要在卵黃細胞核和胚胎滋養(yǎng)層細胞中表達，發(fā)育的晚期Bmbys蛋白主要定位于馬氏管，而在發(fā)育中期未檢測到Bmbys的表達，與Wester.blotting結(jié)果一致。提取家蠶五齡幼蟲各組織的總蛋白，用于Wester.blotting實驗，結(jié)果顯示Bmbys蛋白只在馬氏管中有表達，表明Bmbys可能與馬氏管的發(fā)育有關(guān)。此外，