紅豆杉細(xì)胞系種質(zhì)保存及遺傳變異研究.pdf

1、紅豆杉細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)過(guò)程存在不穩(wěn)定現(xiàn)象，表現(xiàn)在隨著繼代次數(shù)的增加，細(xì)胞合成紫杉醇的能力逐漸下降，這嚴(yán)重制約著紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫醇的的工業(yè)化進(jìn)程，對(duì)于其不穩(wěn)定性機(jī)理已經(jīng)有了一些研究，但尚不明確。因而建立一種穩(wěn)定保存紅豆杉種質(zhì)的方法，可緩解紅豆杉細(xì)胞常溫繼代過(guò)程中的變異。本研究對(duì)紅豆杉細(xì)胞低溫緩I曼生長(zhǎng)保存及其遺傳變異，以及超低溫保存進(jìn)行了研究，獲得如下結(jié)果：
　　 1)首先建立了系列抗前體篩選紅豆杉細(xì)胞系。通過(guò)在培養(yǎng)

2、基中添加苯丙氨酸，苯甲酸鈉和乙酸鈉，經(jīng)半年時(shí)間篩選獲得了產(chǎn)量提高了1.35倍的細(xì)胞系。
　　 2)對(duì)低溫緩慢生長(zhǎng)法保存紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)低溫緩慢生長(zhǎng)法保存前后，紅豆杉細(xì)胞細(xì)胞表觀形態(tài)和紫杉醇產(chǎn)量與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異，但在恢復(fù)培養(yǎng)2個(gè)周期后，細(xì)胞系發(fā)生了變異，表現(xiàn)在紫杉醇含量下降，且保存時(shí)間越長(zhǎng)，含量下降越快。
　　 (2)利用反相高效液相檢測(cè)技術(shù)(HplC)對(duì)低溫保存后恢復(fù)培養(yǎng)

3、過(guò)程中紅豆杉細(xì)胞基因組甲基化水平分析，發(fā)現(xiàn)低溫保存后恢復(fù)培養(yǎng)的細(xì)胞系的DNA甲基化水平升高，表明細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中紫杉醇含量的下降可能與某些基因的甲基化有關(guān)。
　　 3)研究了玻璃化法、預(yù)培養(yǎng)干燥法、干燥/玻璃化法三種方法對(duì)紅豆杉細(xì)胞系進(jìn)行超低溫保存的可行性，初步建立了紅豆杉細(xì)胞超低溫保存體系。
　　 (1)對(duì)影響玻璃化超低溫保存的因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)方式，冰凍保護(hù)劑種類(lèi)，脫水時(shí)間對(duì)紅豆杉細(xì)胞超低溫保存的存活率有比