家蠶煙堿型乙酰膽堿受體與電壓門控鈉通道基因研究.pdf

1、昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)和電壓門控鈉離子通道(Voltage-gated sodium channel，VGSC)是昆蟲神經傳導過程中的重要蛋白，分別為新煙堿類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標。鱗翅目是昆蟲綱第二大目，其幼蟲通常為植食性，其中有許多農業(yè)害蟲。家蠶為鱗翅目模式生物，研究家蠶nAChR和電壓門控鈉通道對害蟲防治具有重要意義。 nAChR基因家

2、族通常含有十個以上的成員，這些成員的組合形成了nAChR復雜的分子類型，對生理功能的研究造成了很大困難。迄今為止，昆蟲nAChR未能通過自己亞基組合在爪蟾卵母細胞內表達，用于電生理學性質的研究和農藥篩選。本文對家蠶nAChR進行了以下研究： 通過Blast檢索家蠶基因組數據庫和RT-PCR、RACE技術，克隆了家蠶12個編碼nAChR亞基基因的全長ORF。家蠶nAChR基因與果蠅nAChR基因相似性最高達86％；其中9個亞基亞基

3、為α型，3個亞基為β型；果蠅、岡比亞按蚊、蜜蜂和家蠶的α6亞基具有相同的內含子位置。 亞基α4含有一對相互排斥的外顯子3，亞基α8含有一對相互排斥的外顯子7。亞基α8相互排斥的外顯子編碼TM2和TM3，迄今為止僅在家蠶中發(fā)現。α4截短的轉錄本缺少外顯子6～8，這些外顯子編碼LoopF和TM1-3。α5截短的轉錄本缺少外顯子4，導致下游閱讀框發(fā)生移碼和翻譯提前終止，只剩下一個很小的開放閱讀框，只有α6亞基上發(fā)現了五個RNA編輯位點

4、，5個堿基的RNA編輯(nts＃392，394，395，447，454)導致了四個氨基酸的變異(N131S,N132G,I149M,T152A)。 使用real-timePCR技術，對七個轉錄本在不同發(fā)育階段，幼蟲不同體段進行了表達量分析。結果表明：所有轉錄本在頭部表達量最高，腹部表達量最低；所有轉錄本在蛹和成蟲階段的表達量都高于幼蟲。在胚胎期，轉錄本α4exon3、α7、β1的表達量高于幼蟲，而轉錄本α2、α8exon7a、α

5、8exon7b的表達量低于幼蟲，轉錄α4exon3表達量和幼蟲相當。在昆蟲細胞中高效表達了所有亞基的胞外受體片段，為受體相互作用研究打下了基礎。 通過家蠶基因組數據庫檢索結果和RT-PCR技術，克隆了家蠶鈉通道基因的全長ORF，命名為BmNav。BmNavORF全長6,258bp，編碼2,085個氨基酸殘基，含有34個外顯子。BmNav和果蠅、德國小蠊、人鈉通道氨基酸序列相似性分別為74％、77％、43％。家蠶鈉通道含有24個跨

6、膜螺旋，分屬于鈉通道的4個結構域，每個結構域含有6個跨膜螺旋。 對胚胎、幼蟲、蛹、成蟲四個發(fā)育時期的BmNavPCR產物進行超通量Solexa測序。測序結果未發(fā)現RNA編輯，發(fā)現BmNav存在大量可變剪接.外顯子丟失除發(fā)生于結構域之間的連接肽之外，還發(fā)生于膜結構，可選擇性外顯子2、外顯子12和外顯子22i編碼結構域之間的連接肽，它們的丟失不影響通道的保守結構，不含外顯子2的轉錄本在四個發(fā)育時期的含量達到33％～55％，外顯子12