轉(zhuǎn)TaEDR1反義基因抗白粉病小麥的選育.pdf

1、由白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speer f.sp.tritici Em.Marchal,Bgt)引起的白粉病是嚴(yán)重危害小友(Triticum aestivum L.)生產(chǎn)的世界性病害。隨著抗病分子生物學(xué)的發(fā)展,小麥抗白粉病相關(guān)基因的克隆研究進(jìn)展很快。研究小麥抗病分子機(jī)理,了解抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑,發(fā)掘信號(hào)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)檗D(zhuǎn)基因抗病小麥的選育奠定理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究參考擬南芥抗病分子機(jī)理研究結(jié)果,通過(guò)

2、RACE技術(shù)克隆了一個(gè)推測(cè)的小麥抗病負(fù)調(diào)控基因TaEDR1,用抑制基因表達(dá)技術(shù)將目標(biāo)基因的一個(gè)反向片段插入到雙元表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)入高產(chǎn)小麥品種‘周麥18’,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。具體研究結(jié)果如下:
　　 1、TaEDR1基因的克隆和鑒定。用RACE技術(shù)對(duì)經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)24 h的小麥-黑麥1BL/1RS易位系99/2439葉片的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,獲得了與大麥HvEDR1基因高度同源的小麥基因全長(zhǎng)cDNA克隆(GenBank登錄號(hào):AY74

3、3662),命名為T(mén)aEDR1基因。TaEDR1基因cDNA全長(zhǎng)3050 bp,編碼959個(gè)氨基酸組成的多肽。高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化功能域存在于TaEDR1的羧基末端。首次提供了證明普通小麥中存在EDR1基因同源物的分子證據(jù)。利用半定量RT-PCR技術(shù),研究了TaEDR1基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)該基因在白粉菌誘導(dǎo)后的葉片中表達(dá)有所增強(qiáng),在葉、穗、莖、根中均有表達(dá)。
　　 2、反義TaEDR1基因表達(dá)載體的構(gòu)建。把TaEDR

4、1基因編碼N-端區(qū)域的片段反向插入到表達(dá)載體pAHC25中,構(gòu)建成反義RNA植物表達(dá)載體。通過(guò)PCR技術(shù)用加有艤酶切位點(diǎn)的一對(duì)特異性引物擴(kuò)增連接有目的基因的表達(dá)載體pCAMBIA-1301/220U-anti-TaEDR1,同時(shí)酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pAHC25分別得劍TaEDR1基因片段和pAHC25載體片段,將TaEDR1基因片段反向插入到pAHC25表達(dá)載體的單子葉植物高效啟動(dòng)子Ubi的卜游和終止子nos3上游。表達(dá)載體保存于大腸