小麥成熟胚脫分化及其植株再生研究.pdf

1、以豫麥18等八種不同基因型小麥成熟胚為外植體，研究了不同處理方式(胚乳支持和胚乳不支持)及不同2，4-D濃度(2mg/L和8mg/L)對小麥成熟胚愈傷組織脫分化和分化的影響；為了研究小麥成熟胚脫分化和分化的生理特性，我們測定了與愈傷組織脫分化和分化有關的(質膜H+-ATPase及草酸鹽氧化酶)兩種酶活性，并對其機理進行了分析。為了進一步對小麥成熟胚再生機理進行研究，通過NorthernBlot對PMH+-ATPase基因的表達水平進行了

2、研究。為了進一步研究PMH+-ATPase的重要作用，我們對小麥PMH+-ATPase基因進行了克隆，并通過生物信息學方法對PMH+-ATPase的結構進行了分析，包括對其三維結果和功能的預測。旨在進一步研究小麥成熟胚脫分化和分化的效果，為小麥成熟胚高效再生體系機理的分析提供一定基礎。結果表明： 1)胚乳不支持條件下，低濃度2，4-D下處理下愈傷組織的誘導率、出苗率分別為82.7％、19.1％;高濃度2，4-D下愈傷組織的誘導率

3、、出苗率分別為82.1％、11.2％；低濃度2，4-D處理有利于小麥成熟胚愈傷組織的脫分化和分化。胚乳支持處理方式的愈傷組織的誘導率較低(52.3％)，但出苗率很高，再生苗率達65.8％.說明胚乳支持的處理方式能高效誘導小麥成熟胚愈傷組織的植株再生。 2)不同處理方式的成熟胚愈傷組織誘導率與綠點率、出苗率間呈一定的負相關，有的達到顯著水平。說明出愈率高，但愈傷組織質量差，難以分化出再生苗，導致出苗率低。說明愈傷組織的質量是植株高

4、效再生的關鍵。 3)胚乳不支持方式下，低濃度2，4-D處理下愈傷組織的草酸鹽氧化酶活性為2.501nmolH2O2/mg.min，高濃度2，4-D處理下愈傷組織的草酸鹽氧化酶活性為2.373nmolH2O2/mg.min，低濃度2，4-D處理有利于小麥成熟胚愈傷組織草酸鹽氧化酶活性的增強；胚乳支持下的愈傷組織酶的活性(2.830nmolH2O2/mg.min)明顯高于胚乳不支持的，達到顯著水平。因此我們可以認為：在小麥愈傷組織分

5、化過程中，草酸鹽氧化酶有利于胚性愈傷組織形成。 4)在胚乳不支持方式下，低濃度2，4-D處理下愈傷組織H+-ATPase的活性高于高濃度2，4-D的處理；胚乳支持方式下，同濃度2，4-D處理的愈傷組織酶的活性明顯高于胚乳不支持的。且隨著處理時間的延長，胚乳支持方式下H+-ATPase活性逐漸升高，72小時活性最高。結合胚乳支持下高的出苗率，可以說明胚乳支持下生成的胚性愈傷組織比較多，再生能力強。因此我們認為：質膜H+-ATPas

6、e在小麥成熟胚愈傷組織植株的高效再生中起一定的作用。 5)NorthernBlot研究表明：不同處理方式下小麥成熟胚愈傷組織質膜H+-ATPase基因mRNA表達水平存在差異，胚乳支持的處理方式增強了質膜H+-ATPase基因在轉錄水平的表達；隨著處理時間的延長，H+-ATPase基因mRNA的表達水平呈現(xiàn)增加，72小時表達量最多，隨后又出現(xiàn)下降的趨勢。結合小麥愈傷組織質膜H+-ATPase活性，可以說明質膜H+-ATPase在

7、小麥成熟胚愈傷組織脫分化和分化過程中起重要作用。 6)對克隆的PMH--ATPase基因進行結構分析表明，基因全長5770bp，其含有15個外顯子和14個內含子。對其推測的PMH+-ATPas生物信息學表明，該酶951個氨基酸組成，分子量為104.6424KD。其一級結構預測表明，該酶親水性區(qū)域有10個明顯的跨膜區(qū)，大部分蛋白質伸展到細胞質內，且在膜內部分有許多β-折疊結構，只有12.7％氨基酸殘基在膜外。存在三個主要結構域：N

8、-末端5-86區(qū)具有一個Cation_ATPase結構域，在98-319段是一個E1-E2-ATPase結構域，在323-609處是一個hydrolase結構域，屬于P型H+-ATPase。該酶有44個功能位點，說明H+-ATPase活性的調節(jié)復雜性。經同源性分析：該酶與玉米，番茄，棉花，蠶豆，擬南芥，馬鈴薯，水稻的H+-ATPase相似性分別達到90.2％，86.8％，84.4％，84.3％，83.1％，81.8％，71.1％，說明不