豬鐵代謝相關(guān)基因的克隆、生物信息學(xué)分析及表達(dá)分布.pdf

1、以EST片段為基礎(chǔ)，電子延伸獲得新的編碼基因，通過RT-PCR技術(shù)克隆得到相關(guān)基因的cDNA序列，并利用生物信息學(xué)工具預(yù)測其相關(guān)生物信息學(xué)性質(zhì)，為進(jìn)一步探討相關(guān)基因的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)利用半定量RT-PCR方法分析了豬細(xì)胞色素b還原酶1（CYBRD1）、豬配對(duì)的二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（DMT1）、豬鐵效應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（IREB2）、豬Fe+3螯合物還原酶1（FRRS1）基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律并利用生物學(xué)軟件對(duì)各基因相對(duì)應(yīng)的蛋白進(jìn)行分析。試

2、驗(yàn)成功克隆了豬細(xì)胞色素b還原酶1（CYBRD1）、豬配對(duì)的二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（DMT1）、豬鐵效應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（IREB2）、豬Fe+3螯合物還原酶1（FRRS1）基因。 克隆的CYBRD1基因長960bp包含了完整的開放閱讀框，編碼285個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。CYBRD1蛋白的分子量為31.53Kda，等電點(diǎn)為9.3，含有32個(gè)酸性氨基酸殘基和28個(gè)堿性氨基酸殘基，在第49～78氨基酸殘基間有一個(gè)B561結(jié)構(gòu)域，在第37

3、～38殘基間有信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)，成熟肽疏水性強(qiáng)。CYBRD1開放閱讀框與人、大鼠、小鼠同源性分別為88.2％，80.7％，81.5％，推測的氨基酸序列同源性分別為84.2％，77.9％，78.9％。有6個(gè)蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)和6段明顯的跨膜區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明CYBRD1蛋白前端及中端有一個(gè)較長α-螺旋，近末端處主要是β-折疊和轉(zhuǎn)角，末端處還有一個(gè)短的α-螺旋。組織表達(dá)規(guī)律分析表明：CYBRD1在空腸表達(dá)量最高，在回腸有中度表達(dá)，在盲腸

4、、結(jié)腸、直腸、脾臟、肌肉有輕度表達(dá)。克隆DMT1基因長1691bp，包含完整的ORF，編碼562個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。 DMT1蛋白的分子量為61.46Kda，等電點(diǎn)為5.78，含有81個(gè)酸性氨基酸殘基和45個(gè)堿性氨基酸殘基，疏水性大于親水性。DMT1蛋白有9段明顯的跨膜區(qū)和17個(gè)蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)。開放閱讀框與人、牛、大鼠、小鼠同源性分別為89.9％、91.1％、87.4％、85.3％。推測的氨基酸序列同源性分別為92.2％

5、、95％、92.3％、90％。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明有一個(gè)較長的α-螺旋幾乎貫穿DMT1始終。組織表達(dá)規(guī)律分析表明：DMT1在十二指腸、心臟、空腸前段有高度表達(dá)，在空腸中后段、肺臟、脂肪、回腸、脾臟有中度表達(dá)，在腎臟、盲腸、結(jié)腸、直腸有輕度表達(dá)。 克隆的FRRS1基因長1785bp包含了完整的ORF，編碼591個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。蛋白的分子量為65.6Kda，等電點(diǎn)為8.82，含有76個(gè)酸性氨基酸殘基和80個(gè)堿性氨基酸殘基，N端的疏

6、水性較強(qiáng)，且位于信號(hào)肽處。在217-359氨基酸殘基之間有一個(gè)DoH的結(jié)構(gòu)域，在26～27氨基酸殘基之間有信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)，蛋白的近末端處有6個(gè)跨膜區(qū)，并有24個(gè)蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)。FRRS1開放閱讀框與牛、人、大鼠變異體1、大鼠變異體2同源性分別為90.3％、87.3％、78.6％、78.6％，推測的氨基酸序列同源性分別為86.6％、76.1％、76.4％、76.4％。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明序列前端及中間部分α-螺旋、β-折疊和轉(zhuǎn)角交替出

7、現(xiàn)，近后端有一較長的α-螺旋。組織表達(dá)規(guī)律分析表明：FRRS1在空腸、升結(jié)腸表達(dá)量較高，在直腸、肌肉、心臟、肝臟、脾臟有中度表達(dá)，在結(jié)腸、胃有輕度表達(dá)。 克隆IREB2基因長2937bp，包含完整的ORF，編碼964個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。蛋白的分子量為105.2Kda，等電點(diǎn)為7.63，含有174個(gè)酸性氨基酸殘基和120個(gè)堿性氨基酸殘基，蛋白的親水性和疏水性基本相當(dāng)。在289-300及670-681氨基酸殘基之間分別有一個(gè)低復(fù)雜

8、性結(jié)構(gòu)。開放閱讀框與人、大鼠、小鼠同源性分別為94.8％、91％、91.1％，推測的氨基酸序列同源性分別為100％、93.8％、94％。IREB2整個(gè)蛋白位于細(xì)胞外，無跨膜區(qū)，共有41個(gè)蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明N端主要以α-螺旋為主，序列的中間及C端α-螺、β-折疊和轉(zhuǎn)角交替出現(xiàn)。組織表達(dá)規(guī)律分析表明：在肌肉、十二指腸、空腸高度表達(dá)，在回腸、脾臟、十二指腸、心臟、肺臟、盲腸、直腸、有中度表達(dá)，在胃、腦、結(jié)腸、腎臟有輕度表達(dá)