油茶PAL基因的全長克隆及其在原核和真核生物中的表達.pdf

1、油茶(Camellia oleifera)是我國重要的木本食用油料樹種,與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料樹種。茶油中油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸的含量在90％以上,是一種優(yōu)質食用油。但是由于病蟲害時常發(fā)生,嚴重影響油茶林的發(fā)展和經濟效益的發(fā)揮。目前,研究較多的與植物抗病性相關的酶是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL),它是苯丙烷類代謝途徑的第一個關鍵酶、限速酶。苯丙烷類代謝化合物對

2、植物生長、抗病、抗逆及構成植物支撐系統(tǒng)方面具有重要作用。因此,對油茶PAL的基因操作具有重要的實際意義。本論文主要在油茶PAL的克隆、鑒定以及表達載體構建方面開展了一些研究工作,主要研究結果如下:
　　 1、油茶PAL基因的全長cDNA克隆及生物信息學分析。從本實驗室油茶cDNA文庫中鑒定出一條PAL基因的全長cDNA,長度為2118bp,經與核酸數據庫進行比對分析,確定為PAL基因,該基因編碼705個氨基酸。應用一系列生物信息

3、學分析方法對其等電點、分子量、跨膜結構、疏水性、二級結構進行預測分析,結果顯示:PAL蛋白質的分子量為77.077KDa,等電點為6.115。PAL整個蛋白的疏水指數從-2.656到3.244,其中除在110位、340位以及480位氨基酸表現出親水性,整條多肽鏈表現出疏水性。PAL蛋白有兩個比較明顯的跨膜區(qū)。PAL蛋白二級結構中α螺旋結構為52.55％,β折疊為6.23％,無規(guī)則卷曲及其他結構達到了41.22％?？v觀PAL蛋白質的整體結

4、構,α螺旋是油茶PAL的主要結構元件,而不規(guī)則卷曲則散布于整個蛋白質中。
　　 2、油茶PAL基因的全長基因組序列克隆。根據油茶PAL全長cDNA序列設計引物,以油茶總DNA為模板,通過PCR反應,克隆油茶PAL基因組序列,結果分析顯示:該基因有一個內含子,長度為768bp,位于起始密碼子下游372bp處,而且內含子兩端具有保守序列GT/AG。
　　 3、油茶PAL基因的原核表達。將編碼油茶PAL的片段定向克隆到pET-

5、28a載體上,構建的原核表達載體命名為pET-PAL。采用24℃低溫誘導重組菌20h,提取細菌粗酶液,檢測酶學活性表明:重組蛋白的最適溫度為70℃,最適pH為8.7。在最適條件下,測得PAL的酶活力為2.583×10-2U,從而計算出苯丙氨酸解氨酶PAL的比活力為36,38μ mol/min·g pro。與其他文獻報道中相比,油茶重組PAL比活力低于大豆、歐芹重組蛋白活性,高于紅酵母重組PAL蛋白的活性,但總體看來,油茶重組PAL活性不