植物學(xué)畢業(yè)論文

1、<p><b>　　海 南 大 學(xué)</b></p><p>　　畢 業(yè) 論 文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　題 目：東寨港紅樹(shù)林吸血蠓的物種多樣性</p><p>　　學(xué) 號(hào)： 20120303310016 </p><p>　　姓 名：

2、 羅玉鳳 </p><p>　　年 級(jí)： 植物保護(hù)一班 </p><p>　　學(xué) 院： 環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 </p><p>　　系 別： 植物保護(hù) </p><p&

3、gt;　　專 業(yè)： 植物保護(hù) </p><p>　　指導(dǎo)教師： 李加慧 </p><p>　　完成日期： 2016年 5 月 17 日 </p><p><b>　　摘 要</b></p><

4、;p>　　紅樹(shù)林是生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶海岸潮間帶或河流入?？诘哪颈局参锶郝洌沁m應(yīng)陸地與海洋過(guò)渡帶的一種特殊森林類型。由于其獨(dú)特的海陸過(guò)渡特性，紅樹(shù)林具有極大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)價(jià)值。紅樹(shù)林作為重要的海岸濕地類型是國(guó)際上濕地生態(tài)保護(hù)和生物多樣性保護(hù)的重要對(duì)象。吸血蠓是一類微小型昆蟲(chóng)，隸屬雙翅目, 蠓科。有吸血習(xí)性的蠓侵襲人畜，傳播疾病，作為病原體的宿主，是一類重要的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)。采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類特征對(duì)吸血蠓進(jìn)行鑒定極易混淆,更難進(jìn)行地

5、理分布與遺傳多樣性分析,近年來(lái)迅速發(fā)展的分子鑒技術(shù)為解決吸血蠓遺傳及鑒定等問(wèn)題提供了有效的手段。本論文綜合利用網(wǎng)捕、人誘和燈誘的方法對(duì)海南東寨港紅樹(shù)林的吸血蠓類進(jìn)行系統(tǒng)采集，基于形態(tài)共成功鑒定出6種庫(kù)蠓，包括棒須庫(kù)蠓Culicoides clavipalpis、環(huán)基庫(kù)蠓Culicoides circumbasalis、霍飛庫(kù)蠓Culicoides huffi、尖喙庫(kù)蠓Culicoides oxystoma、帛琉庫(kù)蠓Culicoides

6、peliliouensis 和Culicoides ornatus 種團(tuán)；系統(tǒng)研究了6種庫(kù)蠓翅的色斑類型、翅脈和翅室的異同，并根據(jù)翅的特</p><p>　　關(guān)鍵詞：吸血蠓；形態(tài)鑒定；分子鑒定；DNA條形碼；紅樹(shù)林</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Mangrove is growth in tropic

7、al and subtropical coast intertidal zone or river mouth of woody plant community, is to adapt to the land and ocean transition zone is a kind of special forest types. Because of its unique sea-land transition characteris

8、tics of mangrove is of great social, economic and ecological value. Mangrove as an important coastal wetland types are international wetland conservation and biodiversity protection of important objects. Vampire midge is

9、 a kind of small insects, dipte</p><p>　　Key words: vampire midge；morphological identification；molecular identification；DNA barcodes；mangrove forest</p><p><b>　　目 錄</b></p>

10、<p><b>　　1前言1</b></p><p><b>　　2吸血蠓的介紹2</b></p><p>　　2.1吸血蠓的形態(tài)特征2</p><p>　　2.2吸血蠓的生活習(xí)性2</p><p>　　2.3吸血蠓的危害3</p><p>　　2.

11、4吸血蠓的防治3</p><p><b>　　3材料與方法4 </b></p><p>　　3.1儀器與設(shè)備4</p><p><b>　　3.2實(shí)驗(yàn)材料4</b></p><p><b>　　3.3標(biāo)本采集4</b></p><p>　　3.

12、4標(biāo)本的制作4</p><p>　　3.5標(biāo)本的鑒定5</p><p>　　3.6基因組DNA提取5</p><p>　　3.7DNA條形碼基因的PCR擴(kuò)增6</p><p>　　3.7.1PCR反應(yīng)條件 6</p><p>　　3.7.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序 7</p><p>

13、<b>　　4 結(jié)果與分析7</b></p><p>　　4.1東寨港紅樹(shù)林吸血蠓類昆蟲(chóng)的的物種多樣性7</p><p>　　4.2東寨港吸血蠓類的分類檢索表8</p><p>　　4.3 吸血蠓的DNA條形碼11</p><p>　　4.3.1PCR擴(kuò)增及電泳產(chǎn)物檢測(cè) 11</p><p&

14、gt;　　4.3.2紅樹(shù)林蠓科昆蟲(chóng)的COI基因的DNA條形碼序列 12</p><p>　　4.3.3 序列比對(duì)結(jié)果 14</p><p><b>　　5結(jié)論與討論15</b></p><p><b>　　5.1結(jié)論15</b></p><p><b>　　5.2討論15<

15、/b></p><p><b>　　致謝17</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)18</b></p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　我國(guó)現(xiàn)知吸血蠓類共有3屬413種，分布于全國(guó)各省區(qū)。其中細(xì)蠓屬有3個(gè)亞屬；刺蠓亞屬為熱帶濱海地區(qū)的蠓

16、類，全世界共有8種，其中7種分布于巴布亞新幾內(nèi)亞、澳大利亞、印度和坦桑尼亞。1種分布于我國(guó)海南三亞（亞龍灣）全蠓亞屬和細(xì)蠓亞屬雖說(shuō)我國(guó)南北皆有，但全蠓亞屬30種多數(shù)分布于我國(guó)古北界省區(qū)內(nèi)，甚至在海拔3500m以上的阿爾金山上也有高山荒漠的特有種群[1]。細(xì)蠓亞屬我國(guó)已知有病9種，多見(jiàn)于南方，其中5種是海島和濱海地區(qū)的蠓種。湖北武當(dāng)山仍然是這兩個(gè)亞屬的交匯區(qū),這里既有廣布川、鄂等地區(qū)的鄖縣細(xì)蠓、又有長(zhǎng)尾細(xì)蠓和原蠓亞屬的白浪細(xì)蠓。從數(shù)量而言

17、，西北地區(qū)細(xì)蠓不僅蠓種多而且密度也高[2]。庫(kù)蠓屬?gòu)V布于世界各地，也是蠓科中最大的吸血蠓屬,。我國(guó)是擁有庫(kù)蠓最多的國(guó)家。其中有典型的古北界蠓種如雪翅庫(kù)蠓和興安庫(kù)蠓只見(jiàn)于東北三省和西藏高原，雖是古北區(qū)廣布蠓種但也見(jiàn)于東洋界內(nèi)，如在我國(guó)既是東北林區(qū)優(yōu)勢(shì)蠓種，同時(shí)也出現(xiàn)于廣西和四川；而異域庫(kù)蠓雖是廣布于兩界的蠓種，但在我國(guó)，尚只見(jiàn)于東部季風(fēng)區(qū)。尖喙庫(kù)蠓除新疆、甘肅、青海尚無(wú)記錄外，北自黑龍江，南抵臺(tái)灣、海南，西抵西藏察隅，聶拉木皆有。原野庫(kù)蠓

18、遍布我國(guó)各省區(qū)，是我</p><p><b>　　2吸血蠓的介紹</b></p><p>　　2.1吸血蠓的形態(tài)特征</p><p>　　蠓類是全變態(tài)雙翅目昆蟲(chóng)，各發(fā)育階段均有其顯著的形態(tài)特征，除具有雙翅目昆蟲(chóng)的基本形態(tài)外，這些特征在不同亞科和不同屬間均有不同。</p><p>　　成蟲(chóng)頭部近球形。復(fù)眼發(fā)達(dá)，呈腎形。雄蠓

19、兩眼相鄰接，雌蠓兩眼距離較遠(yuǎn)。觸角絲狀，分15節(jié)。在觸角基部之后有單眼1對(duì)?？谄鳛榇涛?。中胸發(fā)達(dá)，前、后胸較小，胸部背面呈圓形隆起。有翅一對(duì)，靜止或叮刺時(shí)，相疊平置于腹部背面。翅短寬，翅上常有斑和微毛，其大小、顏色、位置等為分類依據(jù)。體長(zhǎng)多數(shù)為1-5mm，少數(shù)更微小者短約0.7mm，或較大型者長(zhǎng)約7mm，體表有毛，呈黑色、褐色或棕色，或黑白相間。足細(xì)長(zhǎng)。腹部10節(jié)，雌蠓有尾須1對(duì);雄蠓的第9、10腹節(jié)轉(zhuǎn)化為外生殖器。卵的形狀多數(shù)為一端

20、稍細(xì)一端鈍圓的梭形，長(zhǎng)約0.34mm，卵殼表面光滑或有紋、突。幼蟲(chóng)細(xì)長(zhǎng)形，蠕蟲(chóng)狀。除細(xì)蠓外，頭部有角化的頭殼，內(nèi)有具齒的咽和發(fā)達(dá)的大顎。胸部3節(jié)，腹部9節(jié)[4]。</p><p>　　2.2吸血蠓的生活習(xí)性</p><p>　　雌蠓吸血，而雄蠓只吸食植物汁液為營(yíng)養(yǎng)。蠓科種類繁多，嗜食性廣泛，各亞科間食性有別，在不同的種類有一定的傾向性，有的種類嗜吸人血，有的種類嗜吸禽類或畜類血。絕大多數(shù)種

21、類的吸血活動(dòng)是在白天、黎明或黃昏進(jìn)行。但常見(jiàn)的勒蠓屬、庫(kù)蠓屬和拉蠓屬，刺吸哺乳類的血液為主，有少數(shù)刺吸鳥(niǎo)類血液。蠓吸血一般沒(méi)有嚴(yán)格的選擇性，但有的種類也有傾向性，如陳舊庫(kù)蠓等主要吸牛、馬、豬的血，孝庫(kù)蠓主要吸家禽的血;臺(tái)灣拉蠓主要吸人的血;也有的蠓種刺吸禽血等。這些吸血雌蠓須吸足血后，卵巢方能充分發(fā)育。勒蠓、拉蠓在白天吸血;庫(kù)蠓通常在晨、昏吸血。交配時(shí)，雄蠓成群飛舞，雌蠓加入婚舞求偶結(jié)對(duì)后，離群完成交配。 幼蟲(chóng)期生長(zhǎng)發(fā)育的場(chǎng)所稱為滋生地

22、，雌蟲(chóng)選擇滋生地一般以有機(jī)物質(zhì)豐富的蔭涼、潮濕的處所。成蠓平時(shí)多棲息于以草坪、樹(shù)林、竹林、雜草、洞穴等避風(fēng)和避光處，當(dāng)溫度、光線適宜，無(wú)風(fēng)晴天，在草坪、田野、樹(shù)林、溪邊常有成群的蠓群舞。庫(kù)蠓屬成蟲(chóng)往往在日出前和日落后活動(dòng)最頻繁，而勒蠓屬和拉蠓屬則在天亮后活動(dòng)較頻繁。在陰天和無(wú)風(fēng)天蠓活動(dòng)更為頻繁。</p><p><b>　　2.3吸血蠓的危害</b></p><p>

23、　　蠓科昆蟲(chóng)有的可播授花粉或獵食其他昆蟲(chóng)，有的可刺吸人、畜血液，作為傳播疾病的媒介種群，因而蠓類與醫(yī)、農(nóng)、牧、林和園林綠化都有著密切的關(guān)系[5]。通常把蠓科昆蟲(chóng)中吸食人、畜血液的類群稱為吸血蠓類，是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)。它們不僅可以通過(guò)刺叮騷擾直接危害人、畜等動(dòng)物健康；而且還能作為傳播媒介，播散多種病原生物，對(duì)人、畜等動(dòng)物產(chǎn)生間接危害。據(jù)報(bào)道，目前已從蠓體內(nèi)分離或檢測(cè)出寄生蟲(chóng)近20種，病毒30多種，有的病原體已被證明可以在人群中流行和傳播，給

24、人類的健康帶來(lái)嚴(yán)重危害[6]。吸血蠓活動(dòng)的季節(jié)，由于其大量孳生，反復(fù)不斷地對(duì)溫血?jiǎng)游锶缛?、家畜、野生?dòng)物等進(jìn)行騷擾和吸血，被叮刺部位常出現(xiàn)紅點(diǎn)或紅斑，可引起局部皮膚出現(xiàn)紅、腫、痛、癢等過(guò)敏性皮炎癥狀，嚴(yán)重者還可出現(xiàn)丘疹性蕁麻疹。有些蠓種唾液中含有腺苷三磷酸雙酸酶可作為變應(yīng)原引起超敏反應(yīng)的發(fā)生[7]。當(dāng)大量蟲(chóng)體侵襲時(shí)，還可出現(xiàn)過(guò)敏性休克。吸血蠓刺叮騷擾活動(dòng)不僅可引起畜，禽的煩躁不安、食欲不振、機(jī)體消瘦、抵抗力降低等癥狀，而且影響人的正常工

25、作和睡眠。因叮咬部位劇烈痛癢，抓撓使皮膚破損，還可引起繼發(fā)性細(xì)菌性感染。吸血蠓類可攜帶多種病原生物，通過(guò)機(jī)械性傳播和生物性傳</p><p><b>　　2.4吸血蠓的防治</b></p><p>　　吸血蠓的種類多，成蟲(chóng)以野棲為主，其幼蟲(chóng)孳生生境多樣，防治較為困難。過(guò)去我國(guó)媒介昆蟲(chóng)的防治主要是應(yīng)用化學(xué)殺蟲(chóng)劑以達(dá)到防治的目的，在預(yù)防和控制疾病流行方面發(fā)揮了重要的作用。

26、化學(xué)殺蟲(chóng)劑長(zhǎng)期大量使用會(huì)存在媒介昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染等嚴(yán)重問(wèn)題。目前，防治的重點(diǎn)已由過(guò)去單一的化學(xué)防治，轉(zhuǎn)變?yōu)橐陨鷳B(tài)學(xué)研究為基礎(chǔ)，因地、因時(shí)制宜地采取有效的綜合措施，以減少其產(chǎn)生的危害[9]。其防治措施主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:</p><p>　　（1）加強(qiáng)個(gè)人防護(hù) 例如可配戴驅(qū)避頭網(wǎng)，常用的有避蚊胺頭網(wǎng)和驅(qū)蚊靈頭網(wǎng)或83-1型防蠓帽，加強(qiáng)對(duì)頭頸部的個(gè)人防護(hù);也可穿著用復(fù)方緩釋驅(qū)避劑處理的工作服，或用驅(qū)避紙巾

27、、防蚊( 蠓) 叮酊劑、丁香酚緩釋驅(qū)避劑及止癢( 痛) 清涼油( 改進(jìn)配方)涂擦暴露皮膚，其效果反映良好[10]。</p><p>　?。?）加強(qiáng)住所周?chē)h(huán)境治理 環(huán)境治理是指對(duì)周?chē)h(huán)境的處理、改造及改善人們居住條件和習(xí)慣，以達(dá)到減少或防止吸血蠓的孳生和產(chǎn)生的危害。根據(jù)吸血蠓類生活習(xí)性，我們可采取適宜措施和方法以減少吸血蠓的棲息和孳生的場(chǎng)所，例如清除禽畜圈舍周?chē)碾s草，暴露地面，讓陽(yáng)光直接照射，堵塞樹(shù)洞，排除無(wú)用

28、的積水或填平洼地水坑，必要時(shí)可噴灑殺蟲(chóng)劑，以達(dá)到環(huán)境治理的目的。近年來(lái)，人們對(duì)衛(wèi)生害蟲(chóng)的環(huán)境防治也越來(lái)越重視。</p><p>　　（3）采用物理化學(xué)手段防治 物理化學(xué)手段是防治媒介昆蟲(chóng)的常用方法。在吸血蠓高峰活動(dòng)季節(jié)及一日消長(zhǎng)的活動(dòng)高峰時(shí)域，可采用超低容量噴霧殺蟲(chóng)和熱霧殺蟲(chóng)2種方法進(jìn)行化學(xué)殺蟲(chóng)，其中氯菊酯、溴氰菊酯等化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用效果較好，可有效減低成蠓密度[11]。由于廣譜化學(xué)合成殺蟲(chóng)劑易使媒介昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥

29、性且污染環(huán)境，人們開(kāi)始把目光轉(zhuǎn)向使用更加安全、可靠的生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和研制，以達(dá)到防治媒介昆蟲(chóng)的目的。</p><p><b>　　3材料與方法</b></p><p><b>　　3.1 儀器與設(shè)備</b></p><p>　　MOTIC SMZ-140解剖鏡；LX-200小型離心機(jī)；VISOOOO混勻器；TU-100恒溫

30、器；鑷子；解剖針</p><p><b>　　3.2實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　蠓；天根血液細(xì)胞組織基因組DNA提取試劑盒；酒精；蛋白酶溶液；無(wú)水乙醇；ddH2O</p><p><b>　　3.3標(biāo)本采集</b></p><p>　　于2015年10月對(duì)位于演豐的海南東寨港紅樹(shù)林周邊的蠓

31、類利用燈誘、網(wǎng)捕和人誘的方法進(jìn)行了系統(tǒng)采集。</p><p><b>　　3.4標(biāo)本的制作</b></p><p>　　將保存在70%乙醇的蠓取出，在解剖鏡下割下一側(cè)翅，在潔凈的載玻片上先滴一小點(diǎn)膠，而后將割下的翅用解剖針針尖輕挑至該膠中使之平黏于載玻片上。而后將已割翅的蟲(chóng)體移至50%乙醇中，浸15分鐘后移至蒸餾水（涼開(kāi)水也可），在水中浸15分鐘后再換一次水，再浸15

32、分鐘后移至5%-10%的氫氧化鉀（鈉）溶液內(nèi)腐蝕，待在解剖鏡下雌蟲(chóng)受精囊，雄蟲(chóng)尾器等清晰可見(jiàn)即可，通常在室溫中約需6小時(shí)方可。</p><p>　　上述經(jīng)氫氧化鉀腐蝕透明的蟲(chóng)體，再經(jīng)2次水洗、而后再依次經(jīng)50%，70%，80%，90%乙醇各15分鐘脫水后，再在原黏翅的載玻片上的翅側(cè)加一小點(diǎn)膠，將蟲(chóng)體從90%乙醇中挑至膠中，在解剖鏡下將蠓的頭、胸、腹三部解剖開(kāi)，而后分別使頭部正面向上，觸角、觸須理直；胸部側(cè)置，將足

33、理直；腹部腹面向上，尤其尾器要放平。暫不蓋蓋玻片，待1—2天后稍干，使標(biāo)本位置固定后再加一滴膠然后再加蓋玻片。</p><p>　　剛蓋蓋玻片的標(biāo)本一定要平置，以免膠流動(dòng)而使標(biāo)本移位受損。</p><p><b>　　3.5標(biāo)本的鑒定</b></p><p>　　把制作好的標(biāo)本拿到顯微鏡下進(jìn)行翅的形態(tài)觀察，并根據(jù)吸血蠓翅形態(tài)的差異對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分類

34、。</p><p>　　3.6基因組DNA提取</p><p>　　采集的蠓科昆蟲(chóng)經(jīng)分類鑒定后，參照Bellis等 （2013）無(wú)損形態(tài)特征提取蠓科昆蟲(chóng)基因組DNA的方法利用試劑盒法進(jìn)行，具體如下：</p><p>　?。?）蘸取酒精，灼燒鑷子（防止其他DNA的污染）</p><p>　?。?）用鑷子取出吸血蠓放入加180μlBuffer A

35、TL的離心管中，繼續(xù)加入20μl proteinase K 溶液，混勻器振蕩混勻，放入50℃的恒溫器中保溫過(guò)夜，直到組織完全溶解。在進(jìn)行下一步之前進(jìn)行混勻15S。</p><p>　?。?）加入200μlBuffer AL。混勻器振蕩混勻，放入56℃的恒溫器中10min。</p><p>　?。?）加入200μl無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻。</p><p>　　（5）將

36、上述所得溶液都加入到一個(gè)吸附柱中，（吸附柱放入一個(gè)2ml收集管中），8000rpm離心1min。丟棄廢液以及收集管。</p><p>　?。?）將吸附柱放入一個(gè)新的2ml收集管。加入500μlBuffer AW1。8000rpm離心1min。丟棄廢液以及收集管。</p><p>　　（7）將吸附柱放入一個(gè)新的2ml收集管。加入500μlBuffer AW2。14000rpm離心3min。丟

37、棄廢液以及收集管。</p><p>　?。?）把吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml或2ml離心管。</p><p>　?。?）洗滌DNA通過(guò)加入120μlBuffer AE 在吸附柱膜的中心，室溫放置一分鐘，8000rpm離心1min。</p><p>　?。?0）重復(fù)步驟9來(lái)提高DNA產(chǎn)量。</p><p>　　3.7 DNA條形碼基因的PCR

38、擴(kuò)增</p><p>　　選擇動(dòng)物通用的條形碼基因細(xì)胞色素氧化酶I（COI）的基因片段作為分子標(biāo)記。引物為通用引物1718M 和2191M。PCR反應(yīng)緩沖液（表1）。反應(yīng)體系為20μl。ddH2O的量可以上下微調(diào)，但是總體積保持在20μL，以確保PCR擴(kuò)增出來(lái)的濃度較高。</p><p>　　表1 PCR反應(yīng)緩沖液比例</p><p>　　3.7.1 PCR反應(yīng)條件

39、</p><p>　　在干凈的離心管中依次加入如上體系，混合均勻，置于PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件如下：</p><p>　　94℃下變性30S，50℃退火30S，72℃延伸1min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)前94℃預(yù)變性2min，反應(yīng)后72℃延伸5min。</p><p>　　3.7.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序</p><p>　　稱量0.35

40、g的瓊脂糖與35ml的1% TAE混合搖勻，放置于微波爐中，中溫加熱2～3min，冷卻至60℃，滴加7μlGoldview，混勻后倒在模具內(nèi)，室溫冷卻30min，放置于電泳儀內(nèi)，取6μlDNA與1μlLoldingbuffer混合后，點(diǎn)樣，在最后一個(gè)孔中加入10μlMarker。電泳儀電壓調(diào)至130v，設(shè)置時(shí)間為35min。待膠上的條帶距離膠板下緣1cm時(shí)，停止。電泳完成后利用凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照，條帶清晰無(wú)雜帶，送去測(cè)序。</

41、p><p><b>　　4 結(jié)果與分析</b></p><p>　　4.1東寨港紅樹(shù)林吸血蠓類昆蟲(chóng)的的物種多樣性</p><p>　　在東寨港紅樹(shù)林開(kāi)展了吸血蠓類物種多樣性調(diào)查，利用網(wǎng)捕、人誘和燈誘等方法采集標(biāo)本200余頭，并制作玻片標(biāo)本，基于蠓的外部形態(tài)及翅的色斑類型共鑒定庫(kù)蠓屬昆蟲(chóng)6種，具體包括：棒須庫(kù)蠓Culicoides clavipali

42、s、環(huán)基庫(kù)蠓Culicoides circumbasalis、霍飛庫(kù)蠓Culicoides huffi、尖喙庫(kù)蠓Culicoides oxystoma、帛琉庫(kù)蠓Culicoides peliliouensis、Culicoides ornatus種團(tuán)；并對(duì)各物種的翅的色斑類型進(jìn)行了拍照（圖1）。</p><p>　　圖1 東寨港紅樹(shù)林庫(kù)蠓的翅的色斑型</p><p>　　4.2東寨港吸血蠓

43、類的分類檢索表</p><p>　　1 翅小,中肘分叉的前面有圓形的白色斑點(diǎn)(圖2-a)……………………………2</p><p>　　-翅要么中肘分叉的前面沒(méi)有圓形的白色斑點(diǎn)(圖2-b1)要么有大面積的白色 (圖2-b2)………………………………………………………………………………4</p><p><b>　　圖2 翅的色斑型I</b>&l

44、t;/p><p>　　2翅的第三脛室有門(mén)把形狀的標(biāo)記且遠(yuǎn)離第三脛室的頂點(diǎn)處(圖3-a)……………………………………………………尖喙庫(kù)蠓Culicoides oxystoma</p><p>　　-翅小，在第三脛室有圓形的標(biāo)記，位于接近第三脛室的頂端(圖3-b)……………………………………………………………………………………3</p><p><b>　　圖3

45、翅的色斑型Ⅱ</b></p><p>　　3翅上有長(zhǎng)標(biāo)記的斑點(diǎn),直達(dá)中1脈(圖4-a)……………………………………………………棒須庫(kù)蠓Culicoides clavipalis </p><p>　　-翅上有短標(biāo)記的斑點(diǎn),沒(méi)有伸長(zhǎng)很多超越徑分脈(圖4-b)…………………………………………………………霍飛庫(kù)蠓Culicoides huffi</p><

46、p><b>　　圖4翅的色斑型Ⅲ</b></p><p>　　4第三脛室在翅痣頂部有兩個(gè)白色斑點(diǎn)(圖5-a), 第一中室有三個(gè)白色標(biāo)記(圖5-a2)………………………………………………環(huán)基庫(kù)蠓Culicoides circumbasalis</p><p>　　-第三脛室在翅痣頂部有1個(gè)白色斑點(diǎn)(圖5-b1), 第一中室最多有兩個(gè)白色標(biāo)記(圖5-b2)……………

47、………………………………………………………………5</p><p><b>　　圖5翅的色斑型Ⅳ</b></p><p>　　5在第三脛室和第一中室的頂部有白色的斑點(diǎn)且沒(méi)有到達(dá)翅的邊緣(圖6-a)…………………………………………………………Culicoides ornatus 種團(tuán)</p><p>　　-在第三脛室和第一中室的頂部有白色的斑點(diǎn)且

48、到達(dá)翅的邊緣(圖6-b)………6</p><p><b>　　圖6翅的色斑型Ⅴ</b></p><p>　　6徑分脈頂部有白色部分(圖7-a) …………………………………………………7</p><p>　　-徑分脈全部都是深色(圖7-b)………………………………Culicoides niphanae</p><p>&l

49、t;b>　　圖7翅的色斑型Ⅵ</b></p><p>　　7黑色標(biāo)記越過(guò)前肘脈成三角形(圖8-a)………………Culicoides flavipunctatus</p><p>　　-黑色標(biāo)記越過(guò)前肘脈成直角形(圖8-b)………帛琉庫(kù)蠓Culicoides peliliouensis</p><p><b>　　圖8翅的色斑型Ⅶ</

50、b></p><p>　　4.3吸血蠓的DNA條形碼</p><p>　　4.3.1 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳檢測(cè)</p><p><b>　　圖9凝膠電泳圖</b></p><p>　　提取6種吸血蠓的基因組DNA，并以此為模板，以1718M和2191M為引物，如圖9，樣品1初步鑒定為Culicoides ornat

51、us種團(tuán)，樣品2初步鑒定為棒須庫(kù)蠓，樣品3初步鑒定為環(huán)基庫(kù)蠓，樣品4初步鑒定為尖喙庫(kù)蠓，樣品5初步鑒定為霍飛庫(kù)蠓，樣品6初步鑒定為帛琉庫(kù)蠓，標(biāo)號(hào)N為空白對(duì)照，標(biāo)號(hào)M為Marker。</p><p>　　利用引物1718M和2191M對(duì)提取的蠓DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明六種蠓的DNA均能擴(kuò)增出單一且清晰的長(zhǎng)度約520bp的目標(biāo)條帶。</p><p>　　4.3.2紅樹(shù)林蠓科昆蟲(chóng)的CO

52、I基因的DNA條形碼序列</p><p>　?。?）Culicoides ornatus 種團(tuán)測(cè)的的COI基因序列長(zhǎng)度為524 bp，與Culicoides dubius（登錄號(hào)AB361000.1），序列相似度最高（87%），E-value值為7e-167，具體序列為: GGAGGATTGGAAATTGATTAGTACCTCTTATATTAGGAGCCCCTGATATAGCTTTCCCCCGAATAAATAAT

53、ATAAGATTCTGGATACTTCCCCCCTCTCTTTCTCTATTATTAATCAGAAGTTTAGTAGAAAATGGAGCTGGAACAGGTTGAACTGTTTACCCCCCTCTTTCTGCAAACGTTTCACATGCCGGGGCTTCTGTTGACTTAGCAATTTTTTCTCTCCATTTAGCTGGTATTTCTTCAATTCTGGGGGCTGTCAATTTTATTACTACAATTATTAATATACGTT

54、CAAGAGGAATCACATTTGACCGGATACCTTTATTTGTTTGATCTGTTCTTATTACTGCTATTCTTTTACTTTTATCATTACCTGTATTAGCCGGC</p><p>　　(2）棒須庫(kù)蠓測(cè)的的COI基因序列長(zhǎng)度為523 bp，與Culicoides dubius（登錄號(hào)AB361000.1），序列相似度最高（88%），E-value值為4e-164，具體序列為: AATTA

55、AAATATAAACTTCTGGGTGCCCAAAAAATCAAAATAAATGTTGGTATAAGATAGGGTCTCCTCCGCCGGCTGGGTCAAAGAAAGAAGTATTAATATTTCGATCTGTTAATAATATGGTAATAGCGCCGGCTAATACAGGTAATGATAAAAGTAAAAGAATAGCAGTAATAAGAACAGATCAAACAAATAAAGGTATCCGGTCAAATGTGATTCCTCTTGA

56、ACGTATATTAATAATTGTAGTAATAAAATTGACAGCCCCCAGAATTGAAGAAATACCAGCTAAATGGAGAGAAAAAATTGCTAAGTCAACAGAAGCCCCGGCATGTGAAACGTTTGCAGAAAGAGGGGGGTAAACAGTTCAACCTGTCCCAGCTCCATTTTCTACTAAACTTCTGATT</p><p>　?。?）環(huán)基庫(kù)蠓測(cè)的的COI基因序列長(zhǎng)度

57、為511bp，與Culicoides dubius（登錄號(hào)AB361000.1），序列相似度最高（87%），E-value值為2e-163，具體序列為: GGATTTGAAATTGATTAGTACCTCTTATATTAGGAGCCCCTGATATAGCTTTCCCCCGAATAAATAATATAAGATTCTGGATACTACCCCCCTCTCTTTCTCTATTATTAATCAGAAGTTTAGTAGAAAATGGAGCTGGGACA

58、GGTTGAACTGTTTACCCCCCTCTTTCTGCAAACGTTTCACATGCCGGGGCTTCTGTTGACTTAGCAATTTTTTCTCTCCATTTAGCTGGTATTTCTTCAATTCTGGGGGCTGTCAATTTTATTACTACAATTATTAATATACGTTCAAGAGGAATCACATTTGACCGGATACCTTTATTTGTTTGATCTGTTCTTATTACTGCTATTCTTTTACTTTTAT

59、CATTACCTGTATTAGCCGGCGCTATTACCATATTATTAACA</p><p>　　（4）尖喙庫(kù)蠓測(cè)的的COI基因序列長(zhǎng)度為525bp，與Culicoides dubius（登錄號(hào)AB361000.1），序列相似度最高（87%），E-value值為6e-168，具體序列為: TCAGGTAAAAATAAAATATAAACTTCTGGGTGCCCAAAAAATCAAAATAAATGTTGGTAT

60、AAGATAGGGTCTCCTCCGCCGGCTGGGTCAAAGAAAGAAGTATTAATATTTCGATCTGTTAATAATATGGTAATAGCGCCGGCTAATACAGGTAATGATAAAAGTAAAAGAATAGCAGTAATAAGAACAGATCAAACAAATAAAGGTATCCGGTCAAATGTGATTCCTCTTGAACGTATATTAATAATTGTAGTAATAAAATTGACAGCCCCCAGAATTG

61、AAGAAATACCAGCTAAATGGAGAGAAAAAATTGCTAAGTCAACAGAAGCCCCGGCATGTGAAACGTTTGCAGAAAGAGGGGGGTAAACAGTTCAACCTGTCCCAGCTCCATTTTCTACTAAACT</p><p>　?。?）霍飛庫(kù)蠓測(cè)的的COI基因序列長(zhǎng)度為527bp，與Culicoides dubius（登錄號(hào)AB361000.1），序列相似度最高（88%），

62、E-value值為4e-164，具體序列為: AATTAAAATATAAACTTCTGGGTGCCCAAAAAATCAAAATAAATGTTGGTATAAGATAGGGTCTCCTCCGCCGGCTGGGTCAAAGAAAGAAGTATTAATATTTCGATCTGTTAATAATATGGTAATAGCGCCGGCTAATACAGGTAATGATAAAAGTAAAAGAATAGCAGTAATAAGAACAGATCAAACAAATAAAG

63、GTATCCGGTCAAATGTGATTCCTCTTGAACGTATATTAATAATTGTAGTAATAAAATTGACAGCCCCCAGAATTGAAGAAATACCAGCTAAATGGAGAGAAAAAATTGCTAAGTCAACAGAAGCCCCGGCATGTGAAACGTTTGCAGAAAGAGGGGGGTAAACAGTTCAACCTGTCCCAGCTCCATTTTCTACTAAACTTCTGATTA</p>&

64、lt;p>　?。?）帛琉庫(kù)蠓測(cè)的的COI基因序列長(zhǎng)度為526bp，與Cecidomyiidae sp.（登錄號(hào)KJ209188.1）,序列相似度最高（92%）,E-value值為0.0，具體序列為: TCAGGTAAAATTAAAATATAAACTTCTGGATGACCAAAAAATCAAAATAAGTGTTGGTATAAAATAGGATCTCCTCCTCCTATAGGGTCAAAAAATGAAGTATTTAAATTTCGATCA

65、GTAAGTAATATTGTAATAGCTCCTGCTAATACTGGTAAAGATAATAATAGTAAAACAGTAGTAATTAAAATAGATCAAATAAATAATGAAATTTGTTCAAATTTTAAAAATTTATTTTTTATATTTAATATGGTAGAAATAAAATTAATTGCTCCTAAAATAGATGAAATTCCAGCAATGTGAAGAGAAAAAATTGAAAAATCTACAGATGATCCTGTGT

66、GTGCAATAATTGAAGATAAAGGAGGGTAAACCGTTCATCCTGTACCTGTACCTGTTTCTACTATTCTTCT</p><p>　　4.3.2序列比對(duì)結(jié)果</p><p>　　將所得到的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST,比對(duì)如表2：</p><p>　　表 2 蠓的COI序列的Blast比對(duì)結(jié)果</p><p&g

67、t;<b>　　5結(jié)論與討論</b></p><p><b>　　5.1 結(jié)論</b></p><p>　　通過(guò)網(wǎng)捕、人誘和燈誘的方法對(duì)海南東寨港紅樹(shù)林的吸血蠓類進(jìn)行系統(tǒng)采集，基于形態(tài)共成功鑒定出6種庫(kù)蠓，成功構(gòu)建了東寨港吸蠓的分類檢索表，使用DNA條形碼技術(shù)完成了對(duì)6種蠓的分子鑒定。</p><p><b>　

68、　5.2 討論</b></p><p>　　蠓科昆蟲(chóng)中存在許多具有多處相似特征的隱種組成的復(fù)合體或種團(tuán)，沿用傳統(tǒng)靠識(shí)別形態(tài)學(xué)特征的方法對(duì)這類群昆蟲(chóng)進(jìn)行分類和鑒定往往較為困難，進(jìn)而也影響了對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化及其與病原生物關(guān)系的深入研究。因此，尋找可靠的分類鑒定方法，以期快速、準(zhǔn)確地識(shí)別蠓科昆蟲(chóng)，尤其是吸血蠓，是現(xiàn)代昆蟲(chóng)分類學(xué)家研究的重要內(nèi)容之一，也是蠓傳疾病防治工作的基礎(chǔ)。分子分類技術(shù)是以遺傳物質(zhì)DNA序列分

69、析為依據(jù)來(lái)闡述物種間的區(qū)別。它是分子生物學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)與傳統(tǒng)分類學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，作為一種嶄新的分類學(xué)技術(shù)，極大地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的缺陷，已引起越來(lái)越多生物學(xué)家們的重視。</p><p>　　海南島為大陸型島嶼，面積達(dá)33920平方千米，全島地勢(shì)為中部山地向四周遞降海南島是我國(guó)典型的熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣候23.8℃，冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，雨量充沛，植被屬熱帶雨林、熱帶季風(fēng)林類型。海南東寨港屬于近海及海岸濕

70、地類型中的紅樹(shù)林沼澤濕地，而且又是禽類活動(dòng)產(chǎn)地，適宜多類蠓屬孳生，并為吸血蠓提供了血源，所以庫(kù)蠓數(shù)量占優(yōu)勢(shì)。海南1月正是旱季，蠓類作為微小昆蟲(chóng)，這種季節(jié)不是適宜活動(dòng)的季節(jié)。5-10月夏秋為濕季多雷陣雨和臺(tái)風(fēng)，80%-90%雨量集中在5—10月里，這是正是蠓類活動(dòng)的頻繁期，所以把采集時(shí)間選在10月份。這些雖是初步結(jié)果，但對(duì)東寨港紅樹(shù)林吸血蠓的物種多樣性的研究具有重要的參考意義。</p><p><b>　

71、　致謝</b></p><p>　　非常感謝李加慧老師，李加慧老師在我大學(xué)的最后學(xué)習(xí)階段——畢業(yè)設(shè)計(jì)階段給自己的指導(dǎo)，從最初的定題，到資料收集，到寫(xiě)作、修改，到論文定稿，她們給了我耐心的指導(dǎo)和無(wú)私的幫助。為了指導(dǎo)我們的畢業(yè)論文，他放棄了自己的休息時(shí)間，他的這種無(wú)私奉獻(xiàn)的敬業(yè)精神令人欽佩，在此我向他表示我誠(chéng)摯的謝意。同時(shí)，感謝所有任課老師和所有同學(xué)在這四年來(lái)給自己的指導(dǎo)和幫助，是他們教會(huì)了我專業(yè)知識(shí)，教

72、會(huì)了我如何學(xué)習(xí)，教會(huì)了我如何做人。正是由于他們，我才能在各方面取得顯著的進(jìn)步，在此向他們表示我由衷的謝意，并祝所有的老師培養(yǎng)出越來(lái)越多的優(yōu)秀人才，桃李滿天下！</p><p>　　通過(guò)這一階段的努力，我的畢業(yè)論文《東寨港紅樹(shù)林吸血蠓的物種多樣性》終于完成了，這意味著大學(xué)生活即將結(jié)束。在大學(xué)階段，我在學(xué)習(xí)上和思想上都受益非淺，這除了自身的努力外，與各位老師、同學(xué)和朋友的關(guān)心、支持和鼓勵(lì)是分不開(kāi)的。</p>

73、;<p>　　在本論文的寫(xiě)作過(guò)程中，我的導(dǎo)師傾注了大量的心血，從選題到開(kāi)題報(bào)告，從寫(xiě)作提綱，到一遍又一遍地指出每稿中的具體問(wèn)題，嚴(yán)格把關(guān)，循循善誘，在此我表示衷心感謝。同時(shí)我還要感謝在我學(xué)習(xí)期間給我極大關(guān)心和支持的各位老師以及關(guān)心我的同學(xué)和朋友。</p><p>　　寫(xiě)作畢業(yè)論文是一次再系統(tǒng)學(xué)習(xí)的過(guò)程，畢業(yè)論文的完成，同樣也意味著新的學(xué)習(xí)生活的開(kāi)始。我將銘記我曾是一名海大學(xué)子，在今后的工作中把海大的

74、優(yōu)良傳統(tǒng)發(fā)揚(yáng)光大。</p><p>　　感謝各位老師的批評(píng)指導(dǎo)</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]顏忠誠(chéng)，虞以新.吸血雙翅目昆蟲(chóng)多樣性的研究[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，1998,9(1):36-40.</p><p>　　[2]顏忠誠(chéng),虞以新.吸血蠓群落的地理分布[J].動(dòng)物學(xué)

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