雞奇異變形桿菌致病性相關(guān)毒素檢測及PCR檢測方法的建立.pdf

1、雞奇異變形桿菌病是近年來國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種急性熱性細(xì)菌性傳染病。本病的特征是呼吸困難、咳嗽、體溫升高、腹瀉?；疾〖仪葜饕憩F(xiàn)為菌血癥、敗血癥，一側(cè)性或兩側(cè)性癱瘓或水樣腹瀉。各種日齡的雞群都可感染本病，但以7周齡以下的雛雞最易感。種雞感染本病后可通過種蛋傳給后代，從而造成雛雞的大批死亡。此病十分容易造成爆發(fā)性流行疾病，因此對養(yǎng)殖業(yè)是一種潛在的威脅。奇異變形桿菌的致病機(jī)理與其本身所含的一些毒力因子密切相關(guān)，據(jù)推測這些毒力因子可能在雞奇異變形桿

2、菌的病理發(fā)生和免疫方面產(chǎn)生重要的作用?；谏鲜瞿康谋狙芯窟x取了奇異變形桿菌內(nèi)毒素、熱穩(wěn)定性腸毒素和氣管細(xì)胞毒素進(jìn)行研究，初步了解奇異變形桿菌的致病機(jī)理，為研究雞奇異變形桿菌的保護(hù)性抗原提供重要依據(jù)。目前，有關(guān)奇異變形桿菌的檢測通常采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)等多個(gè)步驟，其檢測周期長、操作繁瑣、靈敏度低，不適應(yīng)奇異變形桿菌的快速檢測。近年來發(fā)展起來的分子生物學(xué)方法克服了傳統(tǒng)檢測方法的不足。因此本研究建立了奇異變形桿菌的PC

3、R和多重PCR檢測方法，為該抗原的快速檢測提供技術(shù)依據(jù)，以做到更好的控制該病的發(fā)生與蔓延。本研究主要包括三部分：
　　 ⑴雞奇異變形桿菌相關(guān)毒素的檢測及其致病性研究。本試驗(yàn)精提了奇異變形桿菌內(nèi)毒素和粗提了熱穩(wěn)定腸毒素，通過動(dòng)物試驗(yàn)研究其致病性。同時(shí)建立起雞胚氣管環(huán)模型，驗(yàn)證氣管細(xì)胞毒素的存在及其對氣管纖毛上皮的致病作用。結(jié)果表明：奇異變形桿菌內(nèi)毒素可使動(dòng)物呈急性敗血癥病變。分離的8株奇異變形桿菌有1株為ST陽性，注射ST后的乳鼠

4、運(yùn)動(dòng)遲緩、食欲不振，剖檢可見腸水腫,腸腔積液等。奇異變形桿菌P5、P8株分別作10-8.5、10-8.3倍稀釋，可使SPF雞胚氣管環(huán)接種0.1mL后50％出現(xiàn)氣管環(huán)纖毛脫落，氣管環(huán)粘膜出現(xiàn)凹陷、空洞，初步驗(yàn)證了氣管細(xì)胞毒素的存在及奇異變形桿菌對氣管纖毛的損傷機(jī)理。
　　 ⑴奇異變形桿菌分離株的23S rRNA序列分析。本試驗(yàn)通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增7株雞奇異變形桿菌和1株兔奇異變形桿菌的23S rRNA基因片段（1045bp），經(jīng)克隆

5、測序，與GenBank中收錄的奇異變形桿菌、普通變形桿菌以及其它相近屬的23S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，并由此構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹。本實(shí)驗(yàn)室保存的7株雞奇異變形桿菌核苷酸序列與GenBank中收錄的奇異變形桿菌核苷酸序列同源性為99.4％～99.8％，與兔奇異變形桿菌核苷酸序列同源性為98.8％～99.3％，與普通變形桿菌的核苷酸序列同源性為95.4％～96.2％，而與其它相近屬同源性只有92.9％～93.4％。結(jié)果顯示,23S

6、rRNA基因序列分析可以作為鑒定奇異變形桿菌的一種快速、簡便、準(zhǔn)確的方法。
　　 ⑶多重PCR檢測三種重要食源性致病菌方法的建立及應(yīng)用。本試驗(yàn)根據(jù)奇異變形桿菌尿素酶合成的正向調(diào)節(jié)因子R基因（ureR）、沙門氏菌侵襲性抗原保守基因（invA）和單核細(xì)胞增生性李氏桿菌編碼溶血素O(LLO)的 hlyA基因分別設(shè)計(jì)了三對特異性引物，對單基因PCR和單管多重PCR擴(kuò)增的特異性、敏感性分析以及建立引物濃度、Tm值、模板量的L16(43)正

7、交試驗(yàn)，優(yōu)化單管多重PCR擴(kuò)增條件，建立了快速檢測奇異變形桿菌、沙門氏菌和單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的穩(wěn)定的單管多重PCR方法。結(jié)果顯示，三種目的菌在105cfu/ml均可同時(shí)擴(kuò)增出較清晰條帶(奇異變形桿菌和單核細(xì)胞增生性李氏桿菌在104cfu/ml濃度下仍然可見到條帶)，比單基因PCR低一個(gè)稀釋度，并且人工模擬試驗(yàn)和市售食品試驗(yàn)檢測結(jié)果穩(wěn)定。表明該多重PCR檢測方法操作簡單、快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)對奇異變形桿菌、沙門氏菌和單核