一種好氧反硝化菌的反硝化特性研究

1、<p>　　一種好氧反硝化菌的反硝化特性研究</p><p>　　摘要：本實(shí)驗(yàn)主要研究了影響反硝化菌－A1菌生長(zhǎng)及其反硝化反應(yīng)的因素，包括溫度、初始pH值、碳氮比和碳源，還研究了硝酸根和亞硝酸根呼吸效果的對(duì)比。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，A1菌最適宜生長(zhǎng)的溫度是30oC左右；最適宜的初始pH值在7.0附近；當(dāng)碳氮比在5～6之間時(shí)，A1菌有最好的反硝化效果；有機(jī)酸類(lèi)和糖類(lèi)做碳源時(shí)，A1菌生長(zhǎng)良好，而醇類(lèi)做碳源時(shí)，效果略

2、差；A1菌亞硝酸鹽和硝酸鹽呼吸脫氮率都可達(dá)到90％以上，但亞硝酸根效果略好。 </p><p>　　關(guān)鍵詞：好氧反硝化菌；反硝化效果；反硝化性能 </p><p>　　Abstract：This experiment mainly studies the impact of growth and denitrifying reactions of denitrifying bacteria

3、－A1, including temperature, the initial pH value, C/N, and carbon. Besides it also studies the contrast between the effect of nitrate breathing and nitrite breathing. After that experiment, the most suitable temperature

4、for A1 to grow is about 30 oC ; the most appropriate initial pH value is 7.0 in the vicinity ; when the C/N is between 5 to 6, A1 has the best denitrification effect. w</p><p>　　Key words: Aerobic denitrifyi

5、ng bacteria; Denitrification effect; Denitrification characteristic </p><p>　　中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.11+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： </p><p><b>　　一、前言 </b></p><p>　　氮素是植物何微生物的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一，當(dāng)水體中含N>

6、0.2mg/L，水體就會(huì)營(yíng)養(yǎng)化。[1]水體富營(yíng)養(yǎng)化后會(huì)引起某些藻類(lèi)的惡性繁殖，一方面有些藻類(lèi)本身有藻腥味從而引起水質(zhì)惡化使水體變得腥臭難聞。[2]去年的太湖藍(lán)藻事件中，經(jīng)自來(lái)水廠凈化過(guò)的自來(lái)水都帶有很強(qiáng)烈的腥臭味，致使太湖周?chē)鷰讉€(gè)城市的自來(lái)水停止供應(yīng)達(dá)半個(gè)月之久。[3]另一方面有些藻類(lèi)所含的蛋白質(zhì)毒素會(huì)富集在水產(chǎn)體內(nèi)，并通過(guò)食物鏈影響人體的健康，甚至使人中毒。 </p><p>　　實(shí)驗(yàn)室的生物濾塔在好氧條件下發(fā)

7、生了反硝化作用，推斷濾塔生物膜中生長(zhǎng)有好氧反硝化菌。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)了8株好氧反硝化菌，其中A1菌的反硝化效果最明顯。本實(shí)驗(yàn)就是希望在借鑒前人的基礎(chǔ)上，研究A1菌的反硝化特性，為實(shí)際的工程應(yīng)用提供理論依據(jù)。對(duì)好氧反硝化細(xì)菌進(jìn)行反硝化特性研究，重點(diǎn)是研究影響好氧反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)的幾個(gè)因素：C/N，溫度，初始pH，碳源，氮源等。觀察記錄影響因素與好氧反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)關(guān)系和脫氮效率關(guān)系。 </p><p>　　二、實(shí)驗(yàn)材料及方

8、法 </p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 </b></p><p>　?。?）TU－1810紫外可見(jiàn)光光度計(jì) </p><p>　　（2）HH－1數(shù)顯恒溫水浴鍋 </p><p>　?。?）電熱恒溫水浴鍋 </p><p>　　（4）回旋式振蕩器 </p><p>

9、;　　（5）DYX－250H－B恒溫恒濕培養(yǎng)箱 </p><p>　?。?）YX－280B型手提式壓力蒸汽消毒器 </p><p><b>　　（7）超凈工作臺(tái) </b></p><p>　?。?）PD－501型便攜式多功能測(cè)量?jī)x </p><p>　?。?）各種實(shí)驗(yàn)玻璃儀器 </p><p>　

10、?。?0）微生物A1菌 </p><p>　　2.2 分析檢測(cè)方法 </p><p>　　（1）硝酸鹽的測(cè)定[4]：采用酚二璜酸光度法對(duì)NO3－進(jìn)行測(cè)定。硝酸鹽在無(wú)水條件下與酚二璜酸反應(yīng)，生成硝基二璜酸酚，所得反應(yīng)物在堿性溶液中發(fā)生分子重排，生成黃色化合物，在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。 </p><p>　?。?）亞硝酸鹽的測(cè)定方法[4]：水中亞硝酸鹽的測(cè)定方法通

11、常采用重氮－偶聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)生成紅色染料進(jìn)行紫外分光光度測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)選用對(duì)氨基苯磺酰胺和N－(1氨基)－己二胺作為重氮和偶聯(lián)試劑。在酸性溶液中，亞硝酸鹽能與對(duì)氨基苯磺酰胺起重氮化作用，再與N－(1氨基)－己二胺起偶氮反應(yīng)，生成紫紅色偶氮染料，可在波長(zhǎng)540nm處測(cè)其吸光度。 </p><p>　　三、好氧反硝化菌的特性分析 </p><p>　　3.1溫度對(duì)A1菌好氧反硝化效果的影響 <

12、;/p><p>　　圖3-1溫度對(duì)脫氮率和亞硝酸根生成率的影響 </p><p>　　溫度變化引起A1菌的反硝化率及亞硝酸鹽積累率的情況總結(jié)如圖3-1所示。溫度較低和較高都不利于反硝化，20oC時(shí)脫氮率只有8.10%；溫度大于40oC后脫氮率將低于20.0%。因此，A1菌適合生長(zhǎng)的溫度為25~35oC，在30oC時(shí)脫氮率達(dá)到最高。另外可以發(fā)現(xiàn)，在低溫下A1菌好氧反硝化會(huì)產(chǎn)生少量亞硝酸鹽的積累。

13、反應(yīng)溫度大于30oC時(shí)，沒(méi)有亞硝酸根的積累?？芍獪囟纫矔?huì)影響A1菌硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的活性。溫度低于25oC和高于35oC時(shí)，硝酸根還原酶的活性都會(huì)被抑制，而亞硝酸鹽還原酶的活性會(huì)在溫度低于25oC時(shí)受到抑制。由上可知，菌種A1最適宜的生長(zhǎng)溫度是30oC左右。 </p><p>　　3.2 初始pH值對(duì)A1菌好氧反硝化效果的影響 </p><p>　　圖3-2不同初始pH值對(duì)脫氮

14、率和亞硝酸根生成率的影響 </p><p>　　如圖3-2所示，不同初始pH值的培養(yǎng)液均有不同程度的好氧反硝化反應(yīng)發(fā)生。在較低初始pH值下，A1菌的反硝化效果不明顯。如初始pH值為4時(shí)，只有5%的硝酸根被脫除。隨著初始pH值的升高，脫氮率也逐漸升高。當(dāng)初始pH值為7時(shí)達(dá)到最好的脫氮效果（94.1%）。此后，初始pH值繼續(xù)升高，脫氮率開(kāi)始下降。當(dāng)初始pH值為9.0時(shí)，只有50.20%的硝態(tài)氮被脫除。但相對(duì)于酸性狀態(tài)

15、，堿性狀態(tài)下更易進(jìn)行好氧反硝化反應(yīng)。另外可以發(fā)現(xiàn)，在酸性狀態(tài)下A1菌好氧反硝化會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽的積累，即一部分硝酸鹽根被轉(zhuǎn)化為亞硝酸根，而亞硝酸根沒(méi)有及時(shí)被轉(zhuǎn)化為N2從而產(chǎn)生積累。培養(yǎng)液為中性和堿性時(shí)沒(méi)有亞硝酸根的積累。 </p><p>　　綜上所述，pH值會(huì)影響菌種A1反硝化酶的活性，pH值較低或較高硝酸根還原酶的活性都被抑制。而亞硝酸鹽還原酶的活性在pH值較低時(shí)會(huì)得到抑制。由上可知，菌種A1反硝化最適宜的pH

16、值范圍是7.0左右。 </p><p>　　3.3 碳氮比對(duì)A1菌好氧反硝化的影響 </p><p>　　圖3-3 不同碳氮比時(shí)的脫氮率 </p><p>　　不同碳氮比時(shí)A1菌的反硝化效果是變化的，脫氮率及亞硝酸根生成率總結(jié)如圖3-3所示。由圖可知，好氧反硝化菌A1的總脫氮率隨碳氮比的升高而升高。C/N為1：1時(shí)，總脫氮率只有5.19％，同時(shí)有18.08％的亞硝酸

17、根生成；碳氮比升至2：1時(shí)，脫氮率突增至56.32％，而亞硝酸根的生成率下降到3.81％；碳氮比升至5：1時(shí)，脫氮率升高到91.87％?？梢?jiàn)C/N的大小對(duì)菌種的生長(zhǎng)是一個(gè)重要的影響因素，碳源過(guò)少時(shí)，會(huì)影響總脫氮效果。碳氮比為6:1時(shí)，脫氮率為94.64％，再增加碳源量時(shí)，脫氮效果的變化比較小。綜上所述，碳氮比為5至6是A1菌生長(zhǎng)的最佳值；比值低于5，會(huì)影響脫氮效果；比值高于6則碳源處于過(guò)剩狀態(tài)，但是多余碳源不會(huì)影響菌種生長(zhǎng)及對(duì)亞硝酸根的

18、消耗。 </p><p>　　3.4 不同碳源對(duì)A1菌好氧反硝化的影響 </p><p>　　圖3-4碳源對(duì)脫氮率和亞硝酸根生成率的影響 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用的四種碳源，都可以被A1菌利用。其中，丁二酸鈉和葡萄糖的反應(yīng)效果都很好，24h脫氮率達(dá)到96％；乙酸鈉略差，也可達(dá)到90％；但是乙醇作為碳源時(shí)的反硝化率明顯低于其他碳源，只有34％，且出現(xiàn)了亞硝酸鹽

19、的積累現(xiàn)象。據(jù)研究，微生物可利用的碳源種類(lèi)雖多，但異養(yǎng)微生物在元素水平上最適碳源是“C·H·O”型。“C·H·O”型中的糖類(lèi)是最廣泛利用的碳源，其次是有機(jī)酸類(lèi)、醇類(lèi)和脂類(lèi)等。[5]本實(shí)驗(yàn)菌種的適合碳源為糖類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)，醇類(lèi)不能被微生物直接利用，必須轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸才能被吸收，故乙醇作為碳源，反應(yīng)緩慢。 </p><p>　　3.5 硝酸根與亞硝酸根作為電子受體時(shí)的效果對(duì)比 &l

20、t;/p><p>　　本實(shí)驗(yàn)研究了只投加亞硝酸鹽時(shí)，A1菌的反硝化過(guò)程，并與投加硝酸鹽時(shí)的反硝化過(guò)程進(jìn)行對(duì)比。 </p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-5所示，菌種A1利用亞硝酸鹽的反硝化反應(yīng)過(guò)程生長(zhǎng)良好，在第3h到12h時(shí)，亞硝酸鹽氮的濃度迅速降低，24h后亞硝酸鹽氮已不可檢測(cè)。與硝酸鹽的反應(yīng)過(guò)程相比，亞硝酸鹽的脫除速度略高，反硝化更徹底，說(shuō)明菌種A1的亞硝酸根還原酶的活性比硝酸根還原酶略強(qiáng)。

21、在本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件下，硝酸鹽和亞硝酸鹽都可以作為菌種A1反應(yīng)的電子接收體，且不會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。 </p><p>　　圖3-5菌種A1降解硝酸鹽和亞硝酸鹽的效果 </p><p><b>　　四、結(jié)論與建議 </b></p><p>　　傳統(tǒng)理論認(rèn)為，細(xì)菌的反硝化是一個(gè)嚴(yán)格的缺氧過(guò)程。無(wú)分子態(tài)氧存在時(shí)，反硝化菌才會(huì)利用硝酸鹽和亞硝酸鹽中的氮素作為電子

22、受體，使得硝酸鹽和亞硝酸鹽被還原成N2從水體中去除。然而，細(xì)菌好氧反硝化的發(fā)現(xiàn)，打破了傳統(tǒng)理論的認(rèn)識(shí)，為生物脫氮技術(shù)提供了一種嶄新的思路?！昂醚醴聪趸本褪羌?xì)菌利用好氧反硝化酶在有氧條件下進(jìn)行反硝化的過(guò)程。在目前水體富營(yíng)養(yǎng)化已成為世界性環(huán)境問(wèn)題的情況下，開(kāi)發(fā)高效而經(jīng)濟(jì)的生物脫氮技術(shù)成為世界性研究課題。利用好氧反硝化菌，可以在一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)實(shí)現(xiàn)硝化反硝化，比傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)減少了工藝流程，降低了工程建設(shè)量，提高了經(jīng)濟(jì)性。所以，利用好氧

23、反硝化菌進(jìn)行脫氮比傳統(tǒng)厭氧反硝化脫氮更有優(yōu)勢(shì)。 </p><p><b>　　4.1 結(jié)論 </b></p><p>　　(1) 菌種A1最適宜的生長(zhǎng)溫度是30℃左右，在低溫下A1菌亞硝酸鹽還原酶的活性被抑制，反硝化會(huì)產(chǎn)生少量亞硝酸鹽的積累。 </p><p>　　(2) 菌種A1反硝化最適宜的pH值范圍是7.0左右。在酸性狀態(tài)下A1菌好氧反硝

24、化會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽的積累。 </p><p>　　(3) 碳氮比為5至6是菌種A1生長(zhǎng)的最佳值，但是多余碳源不會(huì)影響菌種生長(zhǎng)及對(duì)亞硝酸根的消耗。 </p><p>　　(4)本實(shí)驗(yàn)采用的四種碳源，都可以被好氧反硝化菌A1利用。其中，丁二酸鈉和葡萄糖的反應(yīng)效果都很好，乙酸鈉略差，乙醇作為碳源時(shí)的反硝化率明顯低于其他碳源。 </p><p>　　(5) 菌種A1利用亞硝酸

25、鹽的反應(yīng)過(guò)程生長(zhǎng)良好，與硝酸鹽的反應(yīng)過(guò)程相比，亞硝酸鹽的脫除速率略高。 </p><p><b>　　4.2 建議 </b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)室所篩選出來(lái)的好氧反硝化細(xì)菌的生理特性與國(guó)外科學(xué)工作者的研究具有一定的差異，很多的特性還需要進(jìn)一步的研究，展望下一步的研究計(jì)劃： </p><p>　　(1) 由于實(shí)驗(yàn)條件有限，本實(shí)驗(yàn)只是驗(yàn)證了

26、部分影響因素對(duì)A1菌好氧反硝化效果的影響。建議以后可以更深入的研究A1菌的反硝化特性。 </p><p>　　(2) 建議通過(guò)誘變得到低碳源下的好氧反硝化細(xì)菌。 </p><p>　　(3) 建議實(shí)驗(yàn)室在研究好氧反硝化細(xì)菌的反硝化特性的同時(shí)可以研究反硝化菌的固定化，以及研究固定化后的好氧反硝化細(xì)菌的生理特性是否會(huì)有變化。 </p><p><b>　　參考

27、文獻(xiàn) </b></p><p>　　[1] 婁金生，謝水波，何少華等.生物脫氮除磷原理與應(yīng)用[M]. 國(guó)防科技大學(xué)出版社，2002,10:3～4。 </p><p>　　[2] 孫錦宜.含氮廢水處理技術(shù)與應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2003:36～39。 </p><p>　　[3] 徐亞同.廢水中氮磷的處理[M].華東師范大學(xué)出版社，1996:6～8。