稻瘟病菌菌株FJ81278無毒基因Avr-Pid2的定位及深度測序分析.pdf

1、稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)上的重要病害之一，嚴重影響各國的糧食安全。培育抗病品種是防治該病最為經(jīng)濟有效的措施，但往往由于稻瘟病菌無毒基因發(fā)生變化的菌株在群體中占優(yōu)勢，導致病菌群體能夠使相對應的抗性基因在田間喪失作用。稻瘟病菌與水稻的互作符合“基因對基因”關系，因此，對稻瘟病菌無毒基因的研究不僅有助于揭示稻瘟病菌的致病機理，而且有助于闡明水稻和稻瘟病菌的互作和進化機制，為水稻抗病品種布局與利用提供重要信息。
　　 為克隆Avr-Pid2

2、，用菌株GUY11和FJ81278及其有性后代群體對水稻品種Pi-d2及其親本TP309進行毒性分析，結果表明：菌株FJ81278對Pi-d2無毒，推測含Avr-Pid2；GUY11和FJ81278的有性后代在Pi-d2上的無毒、有毒分離比例符合1:1，推斷FJ81278對Pi-d2的無毒性由單一基因座控制。通過SSR標記和轉座子元件標記分析，獲得了與無毒基因Avr-Pid2連鎖的標記Propiz-t和ms7-27/28，它們與Avr-

3、Pid2的遺傳距離分別為6.1 cM、13.0 cM。這些標記的獲得將Avr-Pid2限制在染色體上大約420kb的物理距離范圍內，為下一步的精細定位及克隆奠定了良好基礎。
　　 進一步采用深度測序對菌株FJ81278進行基因組和轉錄組分析。結果顯示，菌株FJ81278基因組中預測基因10483個，通過和GUY11基因組比較，獲得FJ81278中特異的基因678個，其中編碼含有信號肽蛋白的基因161個。轉錄組測序分析結果表明，與

4、稻瘟病菌70-15數(shù)據(jù)庫比對，得到9759條已有注釋的轉錄本，未注釋的新轉錄本3706條，占總數(shù)的37.9％；基因結構優(yōu)化有5’端延長和3’端延長；發(fā)現(xiàn)可變剪切基因1464個，占基因總數(shù)的13.0％左右，內含子保留是主要的可變剪接模式；此外還分析出2470個單核苷酸多態(tài)(SNP)位點、1007個插入或缺失多態(tài)性(InDel)位點。以AgriGO分析有表達的轉錄本結果顯示，分子功能、生物學過程和細胞組分3大類被劃分為更詳細的31個小的類別

5、，分類結果顯示了稻瘟病菌發(fā)育各階段基因表達譜的總體情況。分析轉錄豐度較低的基因結果顯示，轉錄豐度較低的基因多是與互作、應激反應有關的基因。通過高通量測序技術發(fā)現(xiàn)了菌株FJ81278批量特異基因及其表達情況，為我們研究稻瘟病菌基因表達的組織特異性和表達水平、致病機制、物種進化和互作機制提供了科學依據(jù)。
　　 已克隆的稻瘟病菌無毒基因多為小的、無同源性的分泌蛋白，因此我們初步把21個編碼蛋白含信號肽(<300aa)的特異基因作為菌株

6、FJ81278中無毒基因的候選基因，通過酵母同源重組進行過表達分析，并在福建田間菌株中做關聯(lián)分析。結果表明，大部分的過表達轉化子對含有抗性基因的水稻的致病性與野生型菌株相同，未發(fā)生毒性變化；對致病性發(fā)生變化的需通過實驗進一步驗證；所研究的特異基因在田間菌株中的擴增結果表明，分子擴增的多態(tài)性與表型無明顯相關，需要用更多的親緣關系較遠的田間菌株對更多的特異基因做關聯(lián)分析。
　　 21個預測含有信號肽的特異基因多無保守結構域，而MoU

7、ng5編碼的蛋白MoHsbA預測含有疏水表面結合蛋白A(HsbA)結構域，對其進行生物信息學分析和表達分析，結果表明，該假定編碼的蛋白含有信號肽剪切位點，是疏水性蛋白。通過qRT-PCR分析該基因在菌絲、孢子、附著胞階段的表達，結果表明該基因在各階段都有表達，但表達量不同，在附著胞階段相對表達水平較高，約是菌絲階段表達量的1.3倍，在孢子階段相對表達量較低。推測MoHsbA可能與稻瘟病菌附著胞的發(fā)育過程密切相關。研究結果為進一步揭示Hs