Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟影響的研究.pdf

1、Ghrelin是日本科學家Kojima1999年發(fā)現(xiàn)的一種由28個氨基酸組成的新的內(nèi)源性腦腸肽，是生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的天然配體。Ghrelin與其受體結(jié)合后有著廣泛的生理功能。因此，Ghrelin的研究進展是目前人們所關注的一個熱點。
　　隨著動物細胞工程、胚胎工程研究的不斷深入，影響動物卵母細胞成熟因素的相關報道主要是一些生殖激素的相關作用

2、原理。那么Ghrelin作為生長激素促分泌素受體的天然配體，它是否參與了綿羊卵母細胞成熟，是否通過經(jīng)典的與細胞生長有關的MAPK信號通路發(fā)揮作用至今未見報道。由于卵母細胞在成熟過程中部分發(fā)生凋亡，而抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax的表達狀況決定了雌性生殖細胞存活與否，Ghrelin在卵母細胞成熟過程究竟與Bcl-2和Bax有何關系目前尚不清楚。針對以上這些懸而未決的問題本論文通過在綿羊卵母細胞體外成熟體系中添加Ghrelin以及G

3、hrelin的受體（GHS-R）特異性拮抗劑D-Lys3-GHRP-6，研究了Ghrelin在綿羊卵母細胞成熟過程中的作用，與MAPK信號級聯(lián)以及Bcl-2和Bax的關系，結(jié)果如下：
　　1、Ghrelin受體GHS-R在綿羊卵母細胞的表達
　　采用RT-PCR技術成功檢測到Ghrelin受體GHS-R在綿羊卵母細胞的表達。2、Ghrelin對綿羊卵母細胞成熟的影響
　　(1)Ghrelin對卵母細胞第一極體排出率、核

4、成熟率有促進作用。而且呈濃度依賴性。
　　(2)D-Lys3-GHRP-6作為Ghrelin受體GHS-R的特異性拮抗劑對卵母細胞第一極體排出率、核成熟率無影響。
　　(3)D-Lys3-GHRP-6可阻斷Ghrelin對卵母細胞體外成熟的促進作用，且對GHS-R拮抗的越完全，Ghrelin的促進作用被阻斷的越顯著。說明Ghrelin是通過與受體GHS-R的結(jié)合而發(fā)揮其對卵母細胞的促成熟作用的。
　　3、實時熒光定量P

5、CR檢測Ghrelin對綿羊卵母細胞MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA表達的影響
　　(1)Ghrelin對卵母細胞MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA的表達有上調(diào)作用，且存在著明顯的劑量、時間依賴關系。
　　(2)D-Lys3-GHRP-6對卵母細胞體外成熟時MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA的表達沒有影響。
　　(3)Ghrelin對 MAPK(ERK1/2)、p90rsk

6、mRNA表達的促進作用可被 Ghrelin受體(GHS-R)拮抗劑D-Lys3-GHRP-6阻斷，且此阻斷作用呈濃度依賴性。
　　4、Western blotting檢測MAPK(ERK1/2)、p90rsk蛋白在綿羊卵母細胞的表達及Ghrelin對磷酸化的MAPK(ERK1/2)、p90rsk蛋白表達的影響
　　(1)MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白在卵母細胞體外成熟過程中表達量沒有明顯變化。
　　(2)卵

7、母細胞體外成熟10h時，MAPK（ERK1/2）、p90rsk被激活，直到24h仍維持高活性。說明卵母細胞MAPK（ERK1/2）、p90rsk是在GVBD期后被激活的。
　　(3)Ghrelin對MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白的表達有上調(diào)作用。
　　(4)Ghrelin對MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白表達的上調(diào)作用可被D-Lys3-GHRP-6阻斷。
　　(5)在卵母細胞體外成熟過程中p90r

8、sk的激活與MAPK（ERK1/2）一致。
　　(6)Ghrelin在卵母細胞體外成熟中所起作用是通過MAPK信號系統(tǒng)發(fā)揮效應的，其增加卵母細胞 GVBD后磷酸化的MAPK（ERK1/2）、p90rsk的表達是通過 Ghrelin受體介導的。
　　5、實時熒光定量PCR檢測Ghrelin對綿羊卵母細胞Bcl-2、Bax mRNA表達的影響
　　(1)Ghrelin對卵母細胞Bcl-2 mRNA的表達有上調(diào)作用。