兩種重要甘薯病毒快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、甘薯卷葉病毒(Sweet potato leaf curl virus，SPLCV)和甘薯褪綠矮化病毒(Sweet potatochlorotic stunt virus，SPCSV)是侵染我國(guó)甘薯的兩種主要病毒，近年來(lái)在我國(guó)主要甘薯產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，給甘薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。建立快速、高效、實(shí)用的的病毒檢測(cè)技術(shù)，加強(qiáng)對(duì)甘薯重要病毒的監(jiān)測(cè)和預(yù)警，對(duì)于甘薯病毒病害的防控具有重要意義。
　　本研究建立了PCR法制備地高辛標(biāo)記探針檢測(cè)甘薯卷葉

2、病毒的核酸雜交法。利用非放射性標(biāo)記物地高辛(DIG)，通過(guò)PCR方法制備了甘薯卷葉病毒(SPLCV) CP基因的探針。通過(guò)對(duì)探針特異性、靈敏性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，建立了SPLCV斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該探針不與其它常見(jiàn)甘薯病毒發(fā)生反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性，最低可檢測(cè)到0.9 ng/μl的病毒樣品，具有較高的靈敏性，可用于甘薯田間樣品SPLCV的檢測(cè)。
　　甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)可劃分為東非(SPCSV-EA)和西非(

3、SPCSV-WA)兩個(gè)株系，近年的檢測(cè)結(jié)果表明，我國(guó)甘薯上主要是SPCSV-WA。本研究根據(jù)GenBank中登錄的SPCSV-WA CP基因序列，本研究利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)，設(shè)計(jì)4條引物，以感染SPCSV-WA甘薯葉片總RNA為模板，進(jìn)行一步法RT-LAMP，在65℃條件下反應(yīng)1h。擴(kuò)增產(chǎn)物利

4、用瓊脂糖電泳分析和SYBR greenⅠ熒光染料顯色判斷結(jié)果，同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行基因克隆和測(cè)序鑒定。利用常規(guī)RT-PCR和建立的RT-LAMP方法對(duì)14份甘薯樣品進(jìn)行SPCSV-WA檢測(cè)，比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。建立的LAMP方法可特異地對(duì)SPCSV-WA進(jìn)行檢測(cè)，且最低可檢測(cè)出101數(shù)量級(jí)的模板。RT-LAMP產(chǎn)物的克隆測(cè)序表明，感染SPCSV-WA甘薯樣品的RT-LAMP產(chǎn)物為SPCSV-WA CP基因序列。14份田間甘薯