棉花害蟲防治新靶標(biāo)漆酶基因的初步研究.pdf

1、漆酶(Laccase)是一種結(jié)合有三個(gè)銅離子的藍(lán)色多銅氧化酶,可以從各種有機(jī)底物上催化轉(zhuǎn)移4個(gè)自由電子使氧氣還原為水。漆酶主要催化一個(gè)通過電子轉(zhuǎn)移發(fā)生的氧化還原反應(yīng)過程。棉鈴蟲是一種夜蛾科昆蟲,為全世界最重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一,在世界各棉區(qū)均有分布,主要危害棉花、玉米、高粱等多種農(nóng)作物。漆酶在棉鈴蟲表皮形成和鞣化過程中起著關(guān)鍵作用,可以做為新型害蟲抑制劑的靶標(biāo)酶,而且漆酶在工業(yè)上極具應(yīng)用價(jià)值。因此,棉鈴蟲的漆酶基因成為研究棉鈴蟲的重要研究對(duì)

2、象。本文首先克隆出棉鈴蟲漆酶基因并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)分析。主要包括以下幾個(gè)方面:
　　(1)以棉鈴蟲cDNA為模板,設(shè)計(jì)特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將目的基因片段連接到pUCm-T載體,成功地克隆出了棉鈴蟲漆酶基因。測(cè)得cDNA序列長(zhǎng)為2280bp,含有完整的開放式閱讀框。去除信號(hào)肽編序列碼后的實(shí)際克隆序列長(zhǎng)為2211bp,編碼737個(gè)氨基酸。
　　(2)通過生物信息學(xué)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,棉鈴蟲漆酶基因與其它鱗翅目昆蟲的漆酶基因有較

3、高同源性。同時(shí)對(duì)漆酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)做出分析。棉鈴蟲漆酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占1.22％,β折疊占22.93%,圈環(huán)和其它隨機(jī)結(jié)構(gòu)占75.85%。
　　(3)本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了一個(gè)基因定向克隆的使用方法。通過XcmⅠ對(duì)pET17ba進(jìn)行酶切,得到線性化的定向克隆載體,該載體兩個(gè)末端的3’端分別突出一個(gè)C和一個(gè)T堿基。測(cè)試分析表明,可保證PCR產(chǎn)物直接定向克隆于表達(dá)載體。通過該方法將前面克隆得到的laccase基因產(chǎn)物進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化,成功構(gòu)建漆酶