綿羊皮膚unigene數(shù)據(jù)庫及其功能分析

1、<p>　　綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫及其功能分析</p><p>　　張文廣1，2 3，張燕軍1，高愛琴1 3，吳江鴻1，3，常子麗1，2，武瑞兵1，麗春1，李金泉1 3,*</p><p>　　1內蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學與醫(yī)學學院，呼和浩特，010018</p><p>　　2內蒙古ATCG生物信息研究所，呼和浩特，010020</p>

2、<p>　　3內蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,呼和浩特, 010020</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　為了輔助羊毛性狀的分子機理研究，以期找到控制羊毛性狀的基因，內蒙古農(nóng)業(yè)大學和內蒙古ATCG生物信息研究所對目前國際上發(fā)表的在綿羊皮膚中表達的基因作了系統(tǒng)總結，構建了綿羊皮膚和毛囊相關基因的數(shù)據(jù)庫和透視分析工具。該

3、數(shù)據(jù)庫包含6360個UniGene及其對應表達序列標簽（EST）的超級鏈接和電子差異顯示分析。這一數(shù)據(jù)庫及其分析工具可以為深入研究毛嚢發(fā)生的分子機理奠定基礎，幫助研究人員開展綿羊皮膚毛囊相關候選基因的研究與產(chǎn)毛性狀QTL的關聯(lián)分析。</p><p>　　Bioinformatics pivotdata for UniGene analysis in wool sheep skin</p><p

4、>　　Zhang Wenguang1,2, Zhang Yanjun1, Gao Aiqin1, </p><p>　　Wu Jianghong1,2, Chang Zili1,2, Wu Ruibing1, Li Jinquan1,*</p><p>　　1 College of Animal Science and Medicine, Inner Mongolia Agricul

5、tural University, Hohhot, 010018</p><p>　　2 Institute of ATCG, Nei Mongol Bio-Information, Hohhot, 010020</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　The Bioinformatics group at t

6、he Inner Mongolia Agricultural University and Institute of ATCG, Nei Mongol Bio-Information is developing bioinformatics tools and resources for scientists engaged in gene analysis in fur-bearing animals. The pivotdata d

7、eveloped encompass both the UniGene database and the associated analytical tool required for differential expression profile of sheep skin. The pivotdata has now been fully implemented for sheep unigene data including 63

8、60 UniGene cluster. We have als</p><p>　　第一作者，張文廣（1973-），副教授，研究方向為，動物遺傳育種與生物信息學。Email： atcgnmbi@yahoo.com.cn。*通訊作者，李金泉（1957-），教授，研究方向為，動物遺傳育種。電話：0471-4309195。</p><p>　　我國是個養(yǎng)羊大國，2005年我國存欄羊總數(shù)為3.73

9、億只，飼養(yǎng)量位居世界第一，其中綿羊17.4億只，占總數(shù)的46.66%[1]。近年來，國內外毛紡產(chǎn)品已經(jīng)向輕薄、柔軟、挺括、高檔方向發(fā)展，世界羊毛生產(chǎn)及貿易突出的變化是超細型羊毛需求增加。因此，加快超細細毛羊品種選育是世界細毛羊育種工作的重點。綿羊大多數(shù)產(chǎn)毛經(jīng)濟性狀都是中度遺傳的，長期以來，人們培育了數(shù)以百計的品種和品系。常規(guī)育種的遺傳進展進展緩慢，一般不足5%。人類基因組和動物基因組研究的新成果不斷激發(fā)廣大畜牧科學工作者嘗試通過標記輔助

10、選擇來提高遺傳改良的速度，甚至完全寄希望于分子育種。因為理論上利用分子育種方法培育品種只需要較少的世代就可以完成，比如2~5代就可育成一個新品種。雖然家畜的數(shù)量性狀是由微效多基因和一些效應較大的所謂主效基因共同決定的，但是人們仍然渴望制成基因診斷試劑盒，期望通過對個別主效基因的選擇就可起到準確選擇種畜的效果。雖然這個夢想還有許多理論和實踐問題需要解決[2]，也有在基因組掃描和侯選基因方面的研究論文不斷發(fā)表，但是，我們必須清醒地認識到人們

11、還沒有找到有效的主效基因用于數(shù)量性狀的分子育種[3]。因此，探討數(shù)量</p><p>　　為了進一步輔助羊毛性狀的分子機理研究，以期找到控制羊毛細度的基因位點或者QTL，為細毛羊的遺傳育種提供理論基礎，急需對目前國際上發(fā)表的有關羊毛性狀發(fā)生和生長中的相關基因作一系統(tǒng)總結，從而為基因芯片設計和候選基因篩選提供生物信息學支撐.內蒙古農(nóng)業(yè)大學和內蒙古ATCG生物信息研究所對不同部位綿羊皮膚表達序列標簽的研究揭示了體側部

12、綿羊毛生長相關的部分基因[4]，該研究結果與國際上已經(jīng)發(fā)表的綿羊皮膚毛囊發(fā)育和皮膚cDNA文庫的成果相結合，構建了綿羊皮膚和毛囊相關基因的數(shù)據(jù)庫和透視分析工具。該數(shù)據(jù)庫和分析工具可以幫助研究人員開展綿羊皮膚毛囊相關的基因表達與系統(tǒng)生物學網(wǎng)絡預測研究。</p><p><b>　　1、數(shù)據(jù)來源</b></p><p>　　表達序列標簽(expressed sequenc

13、e tag, EST)是一個基因的部分轉錄片段，通過構建EST文庫可以較大規(guī)模地獲得基因表達信息。因此EST策略是各物種基因組研究的主要方法，廣泛應用于基因的預測、表達圖譜的構建、芯片及差異表達的研究[5]，但是通過生物學實驗方法獲取EST費時費力，不僅受到通量和規(guī)模上的限制，更受到特定樣本的制約，故難以全面反映相應組織基因表達的整體情況。與此相比，美國國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫dbEST中收錄的EST，涉及了各國科學家對各

14、組織及器官、不同生理狀態(tài)以及不同發(fā)育階段的研究結果，為研究提供了龐大而相對可靠的數(shù)據(jù)。NCBI UniGene則是一個將dbEST的序列進行聚類的數(shù)據(jù)庫，代表同一基因的不同EST被歸入同一UniGene，故一個UniGene可以近似代表一個基因。UniGene數(shù)據(jù)庫中包含了對基因的描述、基因代碼、染色體定位等注釋信息，為大規(guī)模地研究基因表達提供了支持[6]。對這些數(shù)據(jù)庫的整理和挖掘，將為毛囊生物學研究帶來新思路、新信息[5]。作者利用M

15、S-EXCEL VBA宏程序開發(fā)了程序包，建立了利用EST構建綿羊皮膚基</p><p>　　登陸NCBI dbEST數(shù)據(jù)庫(2007-12-20)，查找綿羊皮膚組織EST，以FASTA格式保存于本地計算機。登陸NCBI UniGene數(shù)據(jù)庫(2007-12-20)FTP下載綿羊UniGene，保存于本地計算機[6]。分析在綿羊皮膚中表達的31833條EST，整理后共得到25792條高質量EST可歸入UniGen

16、e，這些EST歸并入6360個非冗余UniGene，占已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的綿羊UniGene（12286）的51.8%。這些UniGene在綿羊皮膚的各種EST庫中共出現(xiàn)11917次，平均出現(xiàn)1.8次。根據(jù)25792條EST統(tǒng)計，其中表達次數(shù)少于5次 的UniGene有5523個，占86.8%，而表達次數(shù)超過100次的只有17個UniGene（圖1）。</p><p>　　圖1 綿羊皮膚中UniGene的表達頻數(shù)及其分布&

17、lt;/p><p><b>　　2、表達譜比較</b></p><p>　　根據(jù)對12個不同實驗室來源的EST庫分析歸類了6360個非冗余基因，為分析綿羊正常皮膚組織的基因表達譜奠定了基礎。該數(shù)據(jù)庫提供了每個UniGene的超鏈接，方便研究者根據(jù)需要快速檢索該基因。例如，現(xiàn)有的電子差異顯示(digital differential display, DDD)方法[6]可用

18、于差異基因的挖掘，獲得的數(shù)據(jù)涵蓋量大，較全面整體地反映了綿羊正常組織的基因表達情況，能夠為研究者提供該基因功能的相關信息（如圖2）。對現(xiàn)有數(shù)據(jù)的整理發(fā)掘將是今后研究的重點和熱點。研究者可以隨時添加新的EST數(shù)據(jù)，能在較短的時間內完成數(shù)據(jù)分析工作。由于該數(shù)據(jù)庫是一個EXCEL版本的本地化的EST分析工具，具有廣泛適用性。該工具可以快速準確地鏈接NCBI的數(shù)據(jù)，分析特定組織或發(fā)育階段的基因表達譜，避免了手工逐條查找基因的繁瑣及保存信息的困難

19、。獲得的信息以Excel格式保存，便于數(shù)據(jù)的查找、比對、分類與統(tǒng)計及后續(xù)的在線分析。同時該EXCEL透視表可通過簡單修改來處理不同形式的分析，獲取不同的信息，不僅能從整體上分析特定基因表達的時空特征，而且還能為挖掘組織特異性基因提供有價值的參考。</p><p>　　圖2 根據(jù)EST計數(shù)獲得的UniGene組織表達譜</p><p>　　不同基因的組織表達譜也有很大差別，揭示在綿羊皮膚中特

20、異表達的基因十分必要。根據(jù)本實驗室測定的羊皮膚EST，獲得1254條在綿羊、山羊、小鼠和人中保守的同源基因（），這些“基因”在小鼠和人的各個組織中的均有不同程度表達（圖3和4），其中的1069和1139個基因分別在小鼠和人的皮膚中表達，反映了皮膚基因表達的共性。</p><p>　　圖3 1254個同源基因在小鼠各組織器官中的分布</p><p>　　圖4 1254個同源基因在人各組織

21、器官中的分布</p><p>　　由于人和小鼠的基因表達數(shù)據(jù)規(guī)模龐大，利用綿羊皮膚中表達的基因與人和小鼠的皮膚中表達的基因比較，可以挖掘保守的皮膚表達基因和差異表達基因，結果表明，在這四個物種中，有1023個基因均在四個物種的皮膚中表達，但是有69個基因只在綿羊和山羊的皮膚中表達（圖5）。對特異表達的69個基因的系統(tǒng)分析將有可能揭示羊絨毛生長的部分分子機制。結合綿羊皮膚表達的UniGene數(shù)據(jù)，利用其中已知的皮膚

22、表達的基因序列，分析這些基因表達的特征對研究皮膚毛囊相關基因意義很大。CSIRO對1089個皮膚表達的EST的原位雜交結果表明，很大比例的EST在表達該基因的皮膚中沒有組織特異性。其中82%非特異表達，13%在毛球表達，4%集中在毛纖維表層（表1）。</p><p>　　圖5 1254個同源基因在綿羊、山羊、小鼠和人皮膚中的分布</p><p>　　表1皮膚EST組織原位雜交匯總<

23、/p><p>　?。ㄒ訡SIRO，2006年）</p><p><b>　　3、功能注釋</b></p><p>　　根據(jù)比較基因組學方法對6360個UniGene的分析結果，其中36.65%（2331個）的UniGene與已知的基因沒有同源序列。以人的GeneOntology為參考數(shù)據(jù)庫[7]，對綿羊皮膚表達的保守基因進行Ontology分析，

24、結果表明，這些基因分別顯著（p<0.01）參與以下Ontology分類，其中生物學過程包括：cellular process(P<0.01)，physiological process(P<0.01)；分子功能包括；binding(P<0.01)，catalytic activity( P<0.01) ，structural molecule activity( P<0.01)，transcripti

25、on regulator activity( P<0.01)，translation regulator activity( P<0.01)；細胞組分包括：cell( P<0.01)，cell part( P<0.01)，envelope( P<0.01)，membrane-enclosed lumen( P<0.01)，organelle( P<0.01)，or</p><

26、p>　　圖6 綿羊皮膚UniGene的功能分布圖</p><p><b>　　4、討論</b></p><p>　　4.1 生物信息數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)</p><p>　　EST是功能基因組研究的重要手段，隨著生物信息數(shù)據(jù)庫中EST的累積,將EST應用</p><p>　　于生物學的研究成為又一熱點。近年來，國外研究人員

27、利用癌癥基因組解剖計劃(cancer genome anatomy project,CGAP)的EST數(shù)據(jù)庫[6]，構建了腦膠質瘤、前列腺癌、卵巢癌等特定組織或疾病的基因表達譜。因此，建立基于NCBI dbEST數(shù)據(jù)庫的本地化基因表達譜分析工具，為功能基因組學的研究提供了新思路、新方法。</p><p>　　生物學數(shù)據(jù)保存在大量的數(shù)據(jù)庫和文本文件中，一般的生物學研究者手工獲取和分析所</p><

28、;p>　　需的數(shù)據(jù)不但耗時耗力，更易導致錯誤。同時由于各實驗室獲得數(shù)據(jù)及存貯數(shù)據(jù)的方式不同，造成了在不同數(shù)據(jù)庫中獲取和比對數(shù)據(jù)的困難，故借助計算機程序自動提取或比較不同來源的數(shù)據(jù)成為分析生物學數(shù)據(jù)不可或缺的方法。EST FASTA格式文件和UniGene文件有固定格式，這就使得提取這兩個文件中匹配的信息構建基因表達譜成為可能。我們構建的綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫方便了研究人員的使用和基因分析。</p><p&

29、gt;　　4.2 綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫的應用</p><p>　　綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫的應用主要體現(xiàn)在兩個方面，一是遺傳標記與UniGene相結合，二是QTL分析與UniGene相結合。為了利用生物信息學方法篩選綿羊微衛(wèi)星標記,可以利用SSRIT和SSRFinder等生物信息學軟件對綿羊UniGene數(shù)據(jù)庫的6360個皮膚表達的UniGene進行搜索，篩選綿羊EST-SSRs標記，這一應用對于綿羊

30、毛相關性狀的標記輔助選擇具有重要應用價值?；蛘呓Y合已經(jīng)獲得的綿羊羊毛性狀的QTL區(qū)域分析結果，與UniGene的遺傳圖譜相關聯(lián)，可以把QTL的分辨率提高到UniGene水平，再利用侯選基因分析和遺傳學驗證，可以把QTL發(fā)展成QTG，真正實現(xiàn)標記輔助選擇。這兩個方面的應用是該數(shù)據(jù)庫的主要優(yōu)點。</p><p>　　4.3 從綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫探討綿羊皮膚生物學的研究方向</p><p&

31、gt;　　羊毛的生長是一個復雜的系統(tǒng)過程。綿羊毛產(chǎn)量與皮膚表面積、毛纖維密度、毛纖維直徑的平方、毛纖維長度成正比。根據(jù)Woolmark的統(tǒng)計，在影響羊毛價值的諸多因素中，羊毛纖維直徑的價值達到總價值的70%，羊毛強度占11%，羊毛長度僅占5%。因此在美麗奴綿羊的選育中，根據(jù)不同的育種目標，均給予毛纖維直徑較大的權重。綿羊毛生長的生物學研究從19世紀50年代開始，并且在細胞水平的發(fā)展過程被研究的相當清楚[8]。提出了控制毛囊形成、毛囊密度

32、和成年動物的毛囊與纖維特征的三個基礎理論：①羊毛毛囊之間的競爭[4]；②一種生物化學模式形成機制（反應—擴散理論）；③皮膚的毛乳頭細胞的一個有限集合體的競爭[7]。雖然這些理論還很不完善，但不管解釋是否正確，一種存在毛囊密度和纖維直徑之間的相互關系是清楚的，當毛囊密度發(fā)生變化時這種相互關系發(fā)生改變。類似的，在長度生長率（L）和纖維直徑（D）之間也存在某種相關性。一種動物在一定的環(huán)境條件下，L/D或L/D2是一個近似的常數(shù)[8]。在羊毛生

33、長的每一個重要成分之間都存在復雜的相互關系，仍然有許多生物學問題需要解決。</p><p>　　為了提高綿羊毛價值和基礎研究的需要，研究者從毛的細微結構、毛囊的生物學調控以及營養(yǎng)物質分配等方面進行了大量研究和總結。這些有價值的研究成果促進了人們對影響羊毛產(chǎn)量和質量的主效基因和QTL的研究。研究者根據(jù)參考家系設計，確定了一些影響羊毛產(chǎn)量和質量的主效基因和QTL。雖然影響羊毛產(chǎn)量和質量的QTL的被逐步鑒定，比如用微衛(wèi)

34、星標記發(fā)現(xiàn)在綿羊第3、6、7、25號染色體上有控制毛纖維各性狀的QTL[9]，但是標記密度影響其選擇效率。由于用合適的標記密度進行基因組掃描的代價相當高，在進一步研究這些羊毛性狀QTL之前需要重新整理這些數(shù)據(jù)。有了數(shù)據(jù)庫中的UniGene數(shù)據(jù)，就可以針對落在某個QTL中的在皮膚中表達的UniGene來做遺傳測試，其代價也會大幅度降低。事實上，在應用分子標記和EST進行遺傳分析之前，許多對羊毛性狀有重要影響的基因已經(jīng)通過他們在表型上的極端

35、影響被鑒定出來，并且通過經(jīng)典雜交的驗證。例如，羊毛的色素沉著方式被許多基因所影響，其中最重要的就是Agouti位點(ASIP)；影響纖維質量最重要的基因是和毛髓有關的N-type基因，根據(jù)COGNOSAG的命名，它已經(jīng)被重新命名為halo—</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　1．中國統(tǒng)計年鑒，中國統(tǒng)計出版社，2006，P486。<

36、/p><p>　　2．張文廣，王雅春，李金泉。數(shù)量遺傳學和基因組學與未來的動物育種學。黃牛雜志，2004，30（5）：31-36。</p><p>　　3．張文廣。內蒙古絨山羊開放核心群優(yōu)化育種規(guī)劃的研究，內蒙古農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2004。</p><p>　　4．Zhang Wenguang, Wu Jianghong, Li Jinquan et. al. OM

37、ICS: A Journal of Integrative Biology. 2007, 11(4): 385-396。</p><p>　　5．徐靜，呂炳建，張昊等。電子基因表達譜分析平臺的建立及其應用。浙江大學學報（工學版），2006，40（2）：186-191。</p><p>　　6．http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, 2008-3-1.</p>

38、<p>　　7．http://www.geneontology.org/, 2008-3-1.</p><p>　　8. 王高富，吳登俊。影響綿羊羊毛性狀的主效基因和QTL?，F(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2006，5：60-63。</p><p>　　9. 曾獻存，陳韓英，彭林澤等。影響羊毛性狀和羊毛品質的主要基因和QTL的研究進展。甘肅畜牧獸醫(yī)，2006，36（5）：39-41。</