msap技術及其在動植物遺傳育種中的研究進展【文獻綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　MSAP技術及其在動植物遺傳育種中的研究進展</p><p>　　摘要：DNA甲基化是表觀遺傳學的重要研究內容之一，它參與了基因表達、生長發(fā)育、逆境脅迫應答等過程，在基因表達的調控中具有重要作用。隨著對

2、DNA 甲基化研究的深入，在AFLP 技術基礎上衍生的DNA 甲基化敏擴增多態(tài)性技術（MSAP），以其高通量、高多態(tài)性、低成本、易操作等優(yōu)點，在各個領域得到廣泛應用。本文綜述了該技術的基本原理與操作，及其研究現狀。</p><p>　　關鍵詞：文蛤，DNA甲基化，MSAP技術</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　文蛤（

3、Meretrix meretrix Linneus）又名花蛤，屬于軟體動物門、雙殼綱、真瓣鰓目、簾蛤科、文蛤屬。其貝殼略呈三角形，腹緣呈圓形，殼質堅厚，兩殼大小相等，喜生活在有淡水注入的內灣及河口附近的細沙質海灘上。文蛤肉嫩味鮮，是貝類海鮮中的上品，其中含有蛋白質10%，脂肪1.2%，碳水化合物2.5%，而且還含有人體易吸收的各種氨基酸和維生素及鈣、鉀、鎂、磷、鐵等多種人體必需的礦物質。文蛤是埋棲型貝類，大多分布在較平坦的河口附近沿岸內

4、灣的潮間帶，以及淺海區(qū)域的細沙，如遼寧遼河口、山東黃河口、江蘇長江口、廣西北海灣等地自然資源豐富。目前，我國文蛤主產區(qū)如東縣沿海地區(qū)大約有35萬畝海灘的養(yǎng)殖規(guī)模，年產有3萬噸左右。</p><p>　　文蛤的全人工育苗技術在我國已有新的突破，但至今工廠化育苗尚未形成生產能力?？抗S化育苗提供大量商品文蛤苗種，目前尚有困難。苗種來源主要依靠采捕自然苗或半人工采苗。以攔網與耙灘相結合的文蛤半人工采苗既簡便，又易操作，

5、成本又低，這一采苗方法是可行的，值得推廣。</p><p>　　1.DNA的甲基化及其分析方法</p><p>　　DNA甲基化是表觀遺傳學的重要研究內容之一，它參與了基因表達、生長發(fā)育、逆境脅迫應答等過程，在基因表達的調控中具有重要作用。甲基化通常發(fā)生在胞嘧啶的C5位，形成5-甲基胞嘧啶(SmC)，甲基化的胞嘧啶多位于CpG島上。CpG島是CpG二聯核苷富集區(qū)域，CG含量大于50％，長約

6、200—500 bp。哺乳動物DNA甲基化的模式只有5mC這一形式，真核生物中大約2％一7％的胞嘧啶被甲基化修飾。</p><p>　　早期的基因組DNA甲基化分析技術，如SssI甲基轉移酶分析法、氯乙醛反應法、免疫學抗體技術等，已不能滿足現代表觀遺傳學研究的需求。近年來常用的基因組甲基化分析方法有兩種：甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorp

7、hism，MSAP)技術和高效液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)。</p><p>　　位點特異性DNA片段甲基化檢測方法有：限制酶PCR、甲基化特異性PCR（MSP）、甲基化敏感的單核苷酸引物延伸(MS-SNuPE)、結合亞硫酸鹽限制性分析法(COBRA)、DHPLC、Methylight、微陣列法。</p><p>　　本

8、次實驗是應用MSAP技術對文蛤四種殼色的DNA甲基化分析，檢測它們的甲基化多態(tài)性，分析它們的甲基化模式，了解文蛤的甲基化水平，從而為建立文蛤不同殼色鑒別的分子標記奠定基礎。</p><p>　　2.MSAP 技術的原理及其方法</p><p>　　MSAP是在AFLP技術的基礎上，用識別5-CCGG序列的限制性內切酶HpaII和MspI代替AnP技術中識別4堿基的內切酶MseI建立起來的新

9、技術。該技術由Reyna-Lopez 等于1997 年首次報道，并被用于檢測二形真菌的DNA 甲基化，之后被用于檢測水稻基因組胞嘧啶甲基化，目前該技術已在油棕、柑橘、高粱、棉花、擬南芥、香蕉、玉米等植物上得到成功應用。</p><p>　　2.1 MSAP技術的原理</p><p>　　采用HpaII和MspI，分別與識別6堿基的EcoRI配對組合對基因組進行酶切，然后再加上相應的限制性內

10、切酶的接頭，利用接頭序列設計引物，對5-CGG位點甲基化進行特異性擴增。盡管HpaII和Msp I都能識別相同的位點，但兩者對DNA甲基化敏感程度存在很大的不同。根據Hpa II和Msp I對基因組DNA甲基化敏感性不同，相同序列可以擴增出不同的譜帶，可以檢測出其總甲基化水平以及有效區(qū)分出基因組DNA的全甲基化(雙鏈甲基化)和半甲基化(單鏈甲基化)等甲基化狀態(tài)。</p><p>　　2.2 MSAP 分析的技術流

11、程</p><p>　　MSAP 技術與AFL P 技術類似，其主要包括DNA 的提取、純化、雙酶切、連接、預擴增、選擇性擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測、記帶和數據整理等步驟。</p><p>　　2.2.1高質量DNA 制備</p><p>　　DNA 提取可以采用CTAB 法或SDS 法大量制備，再采用苯酚-氯仿抽提法純化，然后檢測DNA 質量與濃度，取部分

12、原液稀釋備用。</p><p>　　2.2.2酶切與接頭連接</p><p>　　分別用酶組合EcoRI/HpaII 和EcoRI/MspI 消化DNA 稀釋液，酶切反應在37℃水浴中進行，一般為了保證消化徹底，需酶切6 小時或過夜。然后90℃水浴10 分鐘讓限制酶失活，再加入接頭和連接酶反應3 小時。由于HpaII 和MspI 對CCGG 位點的不同甲基化模式敏感性不同，所以經雙酶切后將

13、得到不同的酶切片段。</p><p>　　2.2.3PCR 擴增</p><p>　　PCR擴增分兩步進行，首先以DNA酶切片段為模板，以選擇性單鏈寡核苷酸作為引物進行預擴增，預擴增的目的在于減少選擇性堿基的錯配，為選擇性擴增提供更多的模板，同時起著純化模板的作用。預擴增完成后，將預擴增PCR產物稀釋后，以此為模板進行選擇性PCR擴增。選擇性擴增與預擴增的主要區(qū)別在于PCR程序中選擇復性溫

14、度的不同，一般選擇PCR起始復性溫度在65 ℃。比預擴增程序復性溫度高10℃左右。以后復性溫度每個循環(huán)下降0．7℃，一直下降至復性效果最佳溫度，完成其余的PCR循環(huán)。</p><p>　　2.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳及統計分析</p><p>　　選擇性PCR擴增產物需要經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染后進行譜帶的觀察與統計分析。對EcoRI∕HpaII和EcoRI∕Msp I泳道的帶紋進

15、行統計分析，每一條帶代表一個酶切識別位點，根據條帶的有無記作1∕0。EcoR I∕Hpa II和EcoRI∕MspI擴增產物中共有條帶，說明該位點未發(fā)生甲基化。如果在EcoRI∕Hpa II酶切擴增產物中有帶，而在EcoRI∕Msp I酶切擴增產物中沒有出現帶，則說明該位點發(fā)生了單鏈外側的胞嘧啶甲基化，即半甲基化。如果EcoRI∕HpaI酶切擴增產物中無帶，而在EcoRI∕Msp I酶切擴增產物中有帶，則說明該位點發(fā)生了雙鏈位點的內側胞

16、嘧啶甲基化，即全甲基化，從而有效區(qū)分基因組DNA甲基化狀態(tài)。</p><p>　　3.MSAP 技術的優(yōu)點與不足</p><p>　　MSAP 是一種改良的AFLP 方法，是一種AFLP與DNA 甲基化相結合的標記，是甲基化敏感限制酶印跡法和AFLP 的集成，它既克服了SouthernBlot 雜交技術復雜的缺點，同時又兼有AFLP 的優(yōu)點。</p><p>　　（

17、一）它能夠有效檢測出樣品DNA 中大量的甲基化位點，具有多態(tài)性高、敏感性高和特異性強等優(yōu)點。</p><p>　?。ǘ┮镌O計簡單，無需事先知道所分析DNA 的序列信息，沒有種屬特異性，可用于DNA 序列背景知識未知的生物。</p><p>　?。ㄈ┛稍谌蚪M范圍對胞嘧啶甲基化程度進行分析又能檢測DNA 片段特異性位點甲基化狀態(tài)。</p><p>　　MSAP

18、法優(yōu)點突出，技術簡單、成本低、效率高，而且結果與基因序列直接聯系起來，為研究基因表達與DNA 甲基化的關系提供了一個十分有效的方法。但也存在不足。</p><p>　　（一），經酶切連接頭后可以出現3 類條帶，一類是兩端都是接頭M/H；另一類是一端是接頭M/H，一端是接頭E；第3 類是兩端都是接頭E。前兩類片段的產生都與CCGG 位點有關，是檢測的目標片段，而第三類則與CCGG 位點無關，屬冗余條帶。但由于Eco

19、RI 屬于稀切酶，所以這類帶出現頻率較低。</p><p>　?。ǘ㎝SAP 法只能檢測全基因組范圍內的CCGG 位點的甲基化變化，對其他位點的甲基化不能檢出，如其他的CG 對稱位點，以及CNG 位點等。</p><p>　　針對以上不足，可以對MSAP 技術加以改進，如多選擇幾組對甲基化敏感性有差異的同裂酶，可以增加檢測位點的多樣性，進一步提高MSAP 檢測信息量，盡量全面反映全基因組

20、范圍內胞嘧啶C-5 位甲基化狀態(tài)。</p><p>　　4.MSAP技術的相關研究</p><p>　　MSAP是在AFLP基礎上建立的，因此不僅具有AFLP的特點，還能檢測DNA甲基化差異，可以作為一種分子標記，進行資源鑒定。</p><p>　　洪柳等對24 個臍橙品種之間進行MSAP 分析，發(fā)現在臍橙品種中DNA 甲基化的發(fā)生頻率很高。臍橙品種芽變頻率高，可能

21、與DNA 甲基化的頻繁發(fā)生密切相關。在所用的18 對MSAP 引物中，有10 對引物可鑒別出12 個臍橙品種，說明MSAP 是檢測臍橙品種之間多態(tài)性的有效方法。Noyer J L等應用SSR、AFLP、MSAP 等技術對30 個香蕉品種的遺傳分析研究中發(fā)現，應用MSAP 分析可以檢測出極高的多態(tài)性片段，并根據品種之間的DNA 甲基化模式的不同有效區(qū)分出30 個品種之間的差異，表明MSAP 技術可以比SSR、ISSR、AFLP 等技術更多

22、檢測出基因組中的多態(tài)性位點，在種質資源鑒定方面顯示出更高的優(yōu)越性。張勇等利用MSAP 技術分析了外源種質導入引發(fā)了小麥表觀遺傳變異，通過染色體工程將外源種質向小麥基因組轉移的過程中，可以誘發(fā)受體物種基因組結構及基因表達的廣泛遺傳變異。MSAP 技術分析結果表明，易位系材料發(fā)生全甲基化修飾的比例比小麥親本明顯上升，而半甲基化比例則明顯下降。</p><p>　　蔣曹德等，應用甲基化敏感擴增多態(tài)技術(MSAP)，對豬

23、個體DNA甲基化百分差異與胴體性狀的關系進行了研究。從個體全部甲基化百分差異、個體中性甲基化百分差異和個體特殊甲基化百分差異3個層次分析了其對胴體性狀的影響。</p><p>　　于濤等運用MSAP技術對櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及其雜交子一代、子二代基因組DNA胞嘧啶甲基化水平進行了研究，并分析了DNA甲基化與各性狀的相關性及其與雜種優(yōu)勢的關系。慶磊等利用MSAP技術研究了二倍體、異源三倍體扇貝甲基化率的變化。<

24、/p><p>　　目前發(fā)現海洋貝類的種類很多，但目前僅在極少部分海洋貝類中有MSAP標記的報道，而在文蛤這種重要的灘涂貝類中還未見有任何報道。</p><p><b>　　小結</b></p><p>　　甲基化作為植物DNA 修飾的重要途徑，參與了許多生命過程，在調控基因表達、調節(jié)生長發(fā)育、防御微生物入侵、耐受逆境脅迫等方面起著重要作用，通過研究

25、基因組DNA 甲基化模式變化，可以深入研究以上過程的調節(jié)機制。MSAP 技術自建立以來，在以上各方面均得到了不同程度應用，若與其它分子生物學方法如DNA 分子遺傳標記、DNA 重組技術、DNA 微陣列等方法結合起來進行綜合研究，將為在分子水平上揭示調控基因時空特異表達機理建立起有力的技術平臺，在雜種優(yōu)勢原理、研究功能基因、改良植物性狀、提高植物適應性等方面發(fā)揮重要作用。</p><p>　　MSAP分子標記技術在

26、植物雜種優(yōu)勢、轉基因沉默、植物組織培養(yǎng)及體細胞無性系變異等方面取得可喜的進展。</p><p>　　這種新技術目前還沒有用于文蛤的報道，由它的優(yōu)越性可以預見，這種技術在文蛤資源種質資源鑒定、基因表達調控、雜種優(yōu)勢預測與利用、轉基因沉默、種群DNA甲基化和環(huán)境適應等方面將具有廣闊的應用前景。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p

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