微生物全基因組范圍內(nèi)的最小基因組研究進展

1、<p>　　微生物全基因組范圍內(nèi)的最小基因組研究進展</p><p>　　摘 要：最小基因組是當前合成生物學研究的熱點，從全基因組代謝網(wǎng)絡研究入手，介紹了最小基因組研究的必要性和技術方法，并對其在工業(yè)微生物分子育種中的應用進行分析，綜合闡述了最小基因組研究的發(fā)展前景。 </p><p>　　關鍵詞：微生物；全基因組；最小基因組；分子育種 </p><p>

2、　　中圖分類號：Q933；Q344+.13 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2013）24-0009-03 </p><p>　　1 基因組代謝網(wǎng)絡 </p><p>　　如今，伴隨著高通量測序技術的應用和費用的降低，全基因組測序技術也越來越受歡迎。通過基因組測序，對基因進行功能注釋，把基因編碼蛋白所催化的生化反應稱為一個代謝網(wǎng)絡，通過計算機轉(zhuǎn)化為數(shù)學模型，再用試驗數(shù)據(jù)加以驗

3、證，提出假設，能夠?qū)ι矬w以及生物現(xiàn)象作出預測，是合成生物學研究中的一個重要的研究手段[1]。 </p><p>　　2 研究最小基因組的必要性 </p><p>　　最小基因組是指在最合適的條件下維持細胞生長繁殖所必需的最少基因[2]，優(yōu)勢小基因組菌株是指含有特殊功能基因/簇的最小基因組菌株。通過對菌株基因組的減縮，可以達到如下目的：①可以提高菌株的代謝效率、降低代謝冗余；②基因組越小，

4、微生物生長速度越快；③增加目標產(chǎn)物合成量，消除副產(chǎn)物[3～5]，解決目前發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中存在的發(fā)酵過程有副產(chǎn)物、底物轉(zhuǎn)化率偏低、生長周期過長、增效因子產(chǎn)量較低和菌株不穩(wěn)定等問題。 </p><p>　　3 最小基因組研究內(nèi)容和手段 </p><p>　　3.1 菌株全基因組測序 </p><p>　　截止到2011年7月1日，據(jù)Genomes Online Databas

5、e數(shù)據(jù)庫報道：6 891株微生物完成全基因組測序，其中包含細菌2 780株、真核微生物121株、古菌107株、病毒2 697株、質(zhì)粒1 186個。越來越多的微生物開始進行全基因組測序[6～13]。 </p><p>　　3.2 必需基因的確定 </p><p>　　必需基因的確定主要有3種方法： </p><p>　?、倮蒙镄畔W預測必需基因[14～17] 第一

6、步，利用在線數(shù)據(jù)庫（Database of Essential Genes，DEG，http：//tubic. tju.edu.cn/deg/）進行分析。將目標菌株的全基因組序列和數(shù)據(jù)庫中同類菌株的基因組數(shù)據(jù)進行對比，如果遺傳相似性大于50%，則可能為必需基因。 </p><p>　　第二步，利用在線分析軟件（http：//tubic.tju.edu.cn/GC-Profile/）分析基因組島。分析結果將全基因組

7、分成N+1個區(qū)域， N+1個區(qū)域的（G+C）%值與全基因組的（G+C）%值進行比對，相差較大的可能是基因組島，即可能通過水平轉(zhuǎn)移獲得的基因，可以刪除。 </p><p>　　第三步，利用在線分析軟件（http：//tubic.tju.edu.cn/Ori-Finder/）分析復制原點，確定oriC的位置和大小，復制原點側翼序列需要保留。 </p><p>　?、诖_立菌株核心編碼區(qū)，確定必需

8、基因 通過選擇同源關系較遠的同屬菌株全基因組序列，確定保守核心編碼區(qū)。 </p><p>　?、弁ㄟ^計算機構建模型 將代謝途徑與數(shù)學符號進行對應，從而構建出全基因組代謝模型[18]。 </p><p>　　4 微生物最小基因組縮小常用的技術手段 </p><p>　　對微生物基因組進行定點無痕修飾是目前基因組縮小常用的技術手段，主要包括：①傳統(tǒng)同源重組；②利用λ-R

9、ed系統(tǒng)的同源重組；③利用Cre/loxP切除系統(tǒng)和Tn轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[19～22]。 </p><p>　　4.1 大腸桿菌基因組的縮短 </p><p>　　大腸桿菌是生物領域被研究得最透徹的模型生物之一，其代謝網(wǎng)絡也被研究得很清楚，因此被用于科研領域、醫(yī)藥研究、發(fā)酵工業(yè)等，生產(chǎn)重組蛋白、氨基酸或者其他化學品。2001年，Mizoguchi等[23]利用2個連續(xù)的λ-Red介導的同源重組（圖

10、1）對Escherichia coli K12菌株進行了基因組刪除，突變株MGF-01蘇氨酸的合成能力是野生株的2倍。 </p><p>　　4.2 枯草芽孢桿菌基因組的縮短 </p><p>　　枯草芽孢桿菌是一種在土壤中廣泛存在的革蘭氏陽性菌，同蘇云金芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌歸類于日蠟樣芽孢桿菌群。因為該菌可以產(chǎn)生很多具有良好生物活性的次級代謝物，所以被研究得很廣泛。Tak

11、uya等[24]2008年通過RecA介導的同源重組（圖 2）對枯草芽孢桿菌的基因組進行了縮短，得到了一系列突變株。突變株MGB874由于缺少0.87 Mb的基因組序列，表現(xiàn)出良好的特性，該突變株MGB874發(fā)酵液中的纖維素酶和蛋白酶活性均比野生型細孢高出約1.7倍和2.5倍，同時還能延長蛋白酶的生產(chǎn)期。 </p><p>　　4.3 鏈霉菌基因組的縮短 </p><p>　　鏈霉菌是一種

12、應用較廣的工業(yè)微生物，能夠合成較豐富的次級代謝產(chǎn)物，如抗生素和一些有應用價值的化合物[25]。Murakami等[26]2007年利用Cre-loxP的位點特異性重組對鏈霉菌的基因組進行了縮短，獲得了一系列的突變體（圖 3）。當使用的培養(yǎng)基為鏈霉菌合成阿佛菌素的最佳培養(yǎng)基時，鏈霉素和頭孢霉素C在突變體菌株中的產(chǎn)量均高于原宿主菌的產(chǎn)量。 </p><p><b>　　5 小結 </b><

13、/p><p>　　目前優(yōu)勢小基因組研究是合成生物學領域研究的熱點。通過基因組縮小研究，能夠構建一個“小且單純”的宿主，來維持外源基因的穩(wěn)定性，以便于大規(guī)模培養(yǎng)。這樣的優(yōu)勢宿主在重組蛋白表達、基因治療或疫苗載體的制備，以及藥用化合物和大宗化學品的制備等方面具有重要應用價值和前景。 </p><p><b>　　參考文獻 </b></p><p>　　

14、[1] 房柯池，王晶.全基因組范圍代謝網(wǎng)絡的構建和最小基因組研究[J].生命科學，2011，23（9）：853-859. </p><p>　　[2] 張柳燕，常素華，王晶.從首個合成細胞看合成生物學的現(xiàn)狀與發(fā)展[J].科學通報，2010，55（36）：3 477-3 488. </p><p>　　[3] 王媛媛，郭文斌，宋存江.工業(yè)微生物菌種改造的新方法――優(yōu)勢小基因組生產(chǎn)菌的構建[J

15、].微生物學報，2012， 　　52（3）：286-294. </p><p>　　[4] Koonin E V. How many genes can make a cell： The minimal gene set concept[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics， 2000（1）： 99-116. </p><p>

16、　　[5] 方宏清，陳惠鵬.大腸桿菌基因組減小研究進展[J].生物技術通訊，2009，20（4）：564-567. </p><p>　　[6] 宋存江.合成生物學技術在功能發(fā)酵制品生產(chǎn)菌種改造中的應用[C]//2012年第五屆全國微生物遺傳學學術研討會論文摘要集.北京：中國知網(wǎng)，2012：11-12. </p><p>　　[7] Cello J， Paul A V， Wimmer E.

17、 Chemical synthesis of poliovirus cDNA： Generation of infectious virus in the absence of natural tem-plate[J]. Science， 2002， 297（5 583）： </p><p>　　1 016-1 018. </p><p>　　[8] Smith H O， Hutchiso

18、n C A， Pfannkoch C， et al. Generating a synthetic genome by whole genome assembly： phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100： 15 440-15 445. </p><p>　　[9] Gi

19、bson D G， Benders G A， Andrews-Pfannkoch C， et al. Complete chemical synthesis， assembly， and cloning of a Mycoplasma genitalium genome[J]. Science， 2008， 319 </p><p>　?。? 867）： 1 215-1 220. </p><

20、p>　　[10] Pósfai G， Plunkett G， Fehér T， et al. Emergent properties of reduced-genome Escherichia coli[J]. Science， 2006， 312（5 776）： 1 044-1 046. </p><p>　　[11] Hashimoto M， Ichimura T， Mizoguch

21、i H， et al. Cell size and nucleoid organization of engineered Escherichia coli cells with a reduced genome[J]. Molecular Microbiology， 2005， 55（1）： 137-149. </p><p>　　[12] Mizoguchi H， Mori H， Fujio T. Esche

22、richia coli minimum genome factory[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry， 2007， 46： 157-167. </p><p>　　[13] Geng W， Cao M， Song C， et al. Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens LL3， whic

23、h exhibits glutamic acid-independent production of poly-γ-glutamic acid[J]. Journal of Bacteriology， 2011， 193（13）： 3 393-3 394. </p><p>　　[14] Mushegian A R， Koonin E V. A minimal gene set for cellular life

24、 derived by comparison of complete bacterial genomes[J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United states of America， 1996， 93： 10 268-10 273. </p><p>　　[15] Koonin E V. Comparative genomi

25、cs， minimal gene-sets and the last universal common ancestor[J]. Natural Reviews Microbiology， 2003（1）： 127-136. </p><p>　　[16] Gao F， Zhang C T. Ori-Finder： A web-based system for finding oriCs in unannotat

26、ed bacterial genomes[J]. BMC Bioinformatics， 2008（9）： 79-84. </p><p>　　[17] Gao F， Zhang C T. GC-Profile： a web-based tool for visualizing and analyzing the variation of GC content in genomic sequences[J]. N

27、ucleic Acids Research， 2006， 34： 686-691. </p><p>　　[18] 陳琦，王卓，魏冬青.代謝網(wǎng)絡流分析進展及應用[J].科學通報，2010，55（14）：1 302-1 309. </p><p>　　[19] Fehér T， Papp B， Pal C， et al. Systematic genome reductions：

28、Theoretical and experimental approaches[J]. Chemical Reviews， 2007， 107： 3 498-3 513. 　　[20] Zhang L， Chang S， Wang J. How to make a minimal genome for synthetic minimal cell[J]. Protein and Cell， 2010（1）： 427-434. <

29、/p><p>　　[21] Baba T， Ara T， Hasegawa M， et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame， single-gene knockout mutants： The Keio collection[J]. Molecular System Biology， 2006（2）： 1-5. </p><p>

30、;　　[22] Lee S Y. Systems biology and biotechnology of Escherichia coli[M]. Daejeon： Republic of Korea （South Korea）， 2009： 19-40. </p><p>　　[23] Mizoguchi H， Mori H， Fujio T. Escherichia coli minimum genome

31、factory[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry， 2007， 46： 157-167. </p><p>　　[24] Takuya M， Ryosuke K， Keiji E， et al. Enhanced recombinant protein productivity by genome reduction in Bacillus subtilis[J

32、]. DNA Research， 2008， 15： 73-81. </p><p>　　[25] Mamoru K， Takuma U， Satoshi O， et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism[J]. Proceedings of the Nation

33、al Academy of Sciences， 2009， 107（6）： 2 646-2 651. </p><p>　　[26] Murakami K， Tao E， Ito Y， et al. Large scale deletions in the Saccharomyces cerevisiae genome create strains with altered regulation of carbo

34、n metabolism[J]. Applied Microbiology Biotechnology， 2007， 75： 589-597. </p><p>　　Advances in Minimal Genome Research in Microbial Whole Genome </p><p>　　LIU Xiaoyan1， MIN Yong1， ZHANG Wei2， WAN

35、G Kaimei1， WAN Zhongyi1， JIANG Aibing1， </p><p>　　ZHANG Guangyang1， CHENG Xianliang1， YANG Ziwen1 </p><p>　　（ 1.National Biopesticide Engineering Research Center， Hubei Biopesticide Engineering

36、Research Center， </p><p>　　Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064； 2.Hubei Vocational College of Bio-technology ） </p><p>　　Abstract： Minimal genome has become the current research

37、focus of synthetic biology. In this paper， we introduced the necessity and technical methods to carry out the research of minimal genome， and analyzed its application in industrial microbial molecular breeding， in additi

38、on， we discussed the development prospect of minimal genome research. </p><p>　　Key words： Microbe； Whole genome； Minimal genome； Molecular breeding </p><p>　　劉曉艷（1979-），女，博士，副研究員，主要從事植物病理學及生物農(nóng)藥

39、分子生物學研究，電話：027-59101919， </p><p>　　E-mail：xiaoyanliu6613@163.com </p><p>　　楊自文，通信作者，電話：027-59101919， </p><p>　　E-mail：lky666888@126.com </p><p>　　收稿日期：2013-10-17</p&