rt-pcr檢測穹窿海馬傘切割后大鼠海馬內(nèi)lhx8 mrna的表達變化

1、<p>　　RT-PCR檢測穹窿海馬傘切割后大鼠海馬內(nèi)Lhx8 mRNA的表達變化</p><p>　　作者：秦建兵，金國華，蔣媛媛，王 磊，朱蕙霞，田美玲，張新化</p><p>　　【摘要】 　　目的：探討切割穹隆海馬傘大鼠海馬與正常海馬內(nèi)Lhx8 mRNA表達的差異。方法：36只SD大鼠隨機分成6組，每組6只。1組為正常對照組，其余5組分別為切割穹窿海馬傘后3、7、14、

2、21和28 d組。取各組大鼠的海馬組織，提取總RNA，采用半定量RT-PCR法分析穹隆海馬傘切割后海馬內(nèi)Lhx8 mRNA的表達變化。結(jié)果：海馬內(nèi)Lhx8 mRNA的表達量在切割后第3 d開始升高，7 d時達到最高水平，以后逐漸下降，于28 d時恢復至正常水平。結(jié)論：切割穹窿海馬傘后海馬中Lhx8 mRNA表達的增高可能與神經(jīng)干細胞向膽堿能神經(jīng)元分化的再生機制有關。 </p><p>　　【關鍵詞】 穹窿海馬傘

3、切割 海馬 Lhx8 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應 大鼠</p><p>　　[Abstract] Objective: To observe the difference of Lhx8 mRNA expression in hippocampi between the fimbria fornix transected rats and normal ones. Methods: 36 SD rats were

4、randomly divided into 6 groups, 6 rats in each group. Group one was the control group, and the others were 3rd, 7th, 14th, 21st and 28th day group after fimbria fornix transected. Then hippocampi were isolated and total

5、RNA was extracted. Semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis was </p><p>　　[Key words] Fimbria fornix transection; Hippocampus; Lhx8; Reverse transcription-polymer

6、ase chain reaction; Rat</p><p>　　移植于切割穹窿海馬傘齒狀回中的神經(jīng)干細胞較正常側(cè)海馬齒狀回中植入的神經(jīng)干細胞更易于存活、遷移和向神經(jīng)元分化[1,2]。體外實驗也證實切割穹窿海馬傘的海馬提取液能明顯促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元和膽堿能分化[3]。這些結(jié)果提示切割穹窿海馬傘后海馬中某些能誘導神經(jīng)干細胞存活、遷移和向神經(jīng)元分化的信號物質(zhì)表達增高。Lhx8是LIM同源盒基因家族中的一員，它主

7、要選擇性的表達在MGE(medial ganglionic eminence, MGE)區(qū)，對于膽堿能神經(jīng)元的分化有至關重要的作用[4]。但迄今為止Lhx8基因在病理模型中的表達研究仍是空白。本研究旨在觀察切割穹窿海馬傘后大鼠海馬內(nèi)Lhx8 mRNA表達是否增高，以推測Lhx8與切割穹窿海馬傘海馬促進移植入其中的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元或膽堿能神經(jīng)元分化關系。</p><p><b>　　1 材料和方法&

8、lt;/b></p><p>　　1.1 實驗動物 SD大鼠36只（南通大學實驗動物中心提供），雌雄不拘，體重220～250 g，隨機分成6組，其中1組為正常對照組，其余5組分別為手術后3、7、14、21和28 d組，每組6只。</p><p>　　1.2 切割大鼠穹窿海馬傘 上述各手術組SD大鼠，經(jīng)腹腔注射復合麻醉劑Chlorpent（0.2 ml/100 g）麻醉

9、后，固定于立體定位儀，暴露前囟，確定前囟坐標A(矢狀軸)、L(冠狀軸)、V(垂直軸)，根據(jù)Paxinos圖譜確定左右兩側(cè)穹隆海馬傘的切割范圍。先在顱骨上確定右側(cè)兩點即：（1）A1=A－1.4、L1＝L－4和；（2）A2＝A－1.4、L2＝L－4；左側(cè)兩點即；（3）A3=A－1.4、L3＝L＋1和（4）A4＝A－1.4、L4＝L＋4，每點各鉆一小孔，用刀片將右側(cè)（1）和（2）、左側(cè)（3）和（4）點間顱骨劃開一條骨縫，將針刀插入腦內(nèi)至切割深

10、度即V1－4＝V+5.4，來回切割3次，退出針刀，待無顱內(nèi)出血后用骨蠟封閉骨縫，縫合皮膚，肌注青霉素，動物按性別分籠飼養(yǎng)。</p><p>　　1.3 RNA的提取和保存 正常組及手術后各組大鼠經(jīng)上述方法麻醉后，斷頸處死，無菌條件下剝?nèi)ワB骨和硬腦膜，再去除大腦皮質(zhì)和胼胝體，證實兩側(cè)穹窿海馬傘被切斷后，取出兩側(cè)海馬組織，用Trizol法提取RNA，沉淀用50 μl DEPC-H2O溶解。取少量樣品進行紫外定

11、量，用甲醛變性電泳鑒定RNA質(zhì)量，其余樣品保存于－70 ℃冰箱中備用。</p><p>　　1.4 半定量RT-PCR 選用磷酸甘油醛脫氫酶 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因為內(nèi)參照。反應中所用GAPDH上游引物為：5'-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3'，下游引物為：5'-TCCACCACCCTGTTG

12、CTGTA-3'，擴增產(chǎn)物為452 bp；Lhx8上游引物為：5'-ATGTATTGGAAGAGCGATCAG-3'，下游引物為：5'-TCATTGGATGGGG TAACAAGGGC-3'，擴增產(chǎn)物為1102 bp。GAPDH和Lhx8的cDNA序列查自GenBank，引物由上海英駿公司合成。PCR反應：將目的基因與內(nèi)參基因的引物置同一管內(nèi)行PCR擴增，反應體系按試劑DNA聚合酶(MBI公司)說

13、明書操作。預變性94 ℃、3 min，然后94 ℃、45 s，60 ℃、30 s，72 ℃、65 s，30個循環(huán)；最后72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析，捷達圖像分析系統(tǒng)對凝膠各泳道中的GAPDH和Lhx8條帶進行光密度掃描。</p><p>　　1.5 統(tǒng)計學方法 以各泳道中Lhx8與GAPDH條帶的光密度比值表示Lhx8 mRNA的相對表達量，建立相對表達量柱形圖。數(shù)據(jù)輸入

14、Stata7.0統(tǒng)計軟件，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗（SNK法）。</p><p>　　2 結(jié) 果</p><p>　　2.1 RNA分析 3 μl RNA樣品經(jīng)甲醛－瓊脂糖凝膠變性電泳，120 V電壓電泳25 min，紫外燈下觀察到28 S RNA∶18 S RNA約為1.5∶1，5 S RNA呈淡云霧狀，表明樣品為RNA，且無降解。另

15、取樣品在蛋白核酸測定儀上檢測OD值，各組OD260/OD280均在1.8~2.0，說明所提取的RNA純度較高，無污染。</p><p>　　2.2 半定量RT-PCR檢測結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，以DL-2000 DNA Marker為標準，擴增產(chǎn)物及內(nèi)參大小與預期結(jié)果相符（分別為1102 bp和452 bp）。穹隆海馬傘切割后不同時間點Lhx8 mRNA相對表達量如圖2所示。方差分析和均數(shù)兩兩

16、比較表明，切割后28 d組與正常對照組相比，Lhx8 mRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P&gt;0.05)，3 d、7 d、14 d和21 d組與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P&lt;0.05)；比較切割后不同時間組，各組間的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P&lt;0.05)。說明Lhx8 mRNA表達量自切割后第3 d開始升高，7 d時達到最高水平，以后開始下降，于28 d左右恢復至正常水平。</

17、p><p>　　3 討 論</p><p>　　3.1 Lhx8基因與膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育 神經(jīng)干細胞以其自我更新、增殖和多向分化潛能等特性已經(jīng)成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病的理想細胞材料。如何調(diào)控神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元尤其是向特定表型的神經(jīng)元(如膽堿能、多巴胺能等神經(jīng)元)分化，已成為研究人員關注的熱點和難點。Lhx8[4]是最近新鑒定的LIM同源盒基因家族中的成員之一，

18、又稱為L3、Lhx7，特異性地在胚胎基底前腦和口腔間質(zhì)中表達。Zhao等定向敲除小鼠Lhx8基因后發(fā)現(xiàn)膽堿能標記的神經(jīng)元減少，從而發(fā)現(xiàn)Lhx8在膽堿能神經(jīng)元的分化中起積極的作用[4]。Manabe等利用RNA干擾技術發(fā)現(xiàn)Lhx8的選擇性定位和它的功能性配體對于基底前腦中的膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育有重要作用[5]。關于Lhx8在病理狀態(tài)下的腦組織如切割穹窿海馬傘后的海馬中表達的變化，以及在穹窿海馬傘切割后的海馬膽堿能神經(jīng)元的再生中是否扮演著重要

19、角色則尚未見有報道。</p><p>　　3.2 切割穹窿海馬傘海馬中Lhx8 mRNA的上調(diào)可能與膽堿能神經(jīng)再生有關 穹窿海馬傘中不僅含有海馬錐體細胞層和齒狀回顆粒層細胞投射至丘腦前核、乳頭體核、隔外側(cè)核及斜角帶核的傳出纖維，而且還含有基底前腦內(nèi)側(cè)隔核和斜角帶垂直支投射到海馬的膽堿能傳入纖維[6,7]。內(nèi)側(cè)隔核的膽堿能神經(jīng)元發(fā)出纖維經(jīng)海馬傘和背側(cè)穹窿這一隔-海馬通路與海馬結(jié)構(gòu)建立廣泛的聯(lián)系，這一膽堿能投

20、射系統(tǒng)被認為與學習記憶和認知功能密切相關[8]。穹窿海馬傘切斷后，阻斷了隔區(qū)等相關經(jīng)穹窿海馬傘投射到海馬的膽堿能神經(jīng)纖維，使該側(cè)海馬失去了膽堿能神經(jīng)支配，導致乙酰膽堿缺失，使得海馬內(nèi)的微環(huán)境發(fā)生變化，而引起切割側(cè)海馬中某些物質(zhì)的表達增強，而這些物質(zhì)對激活自體的神經(jīng)干細胞或植入的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元或膽堿能神經(jīng)元分化起到了促進作用[2]。結(jié)合本課題組此前研究的結(jié)果，推測本實驗切割側(cè)海馬Lhx8 mRNA的表達上調(diào)，除了可能是切割穹窿海馬傘后

21、海馬中的細胞對抗損傷的一種反應外，更可能是海馬中啟動了膽堿能神經(jīng)再生機制，是對抗海馬內(nèi)乙酰膽堿遞質(zhì)缺失后的一種反應。但究竟是變化了微環(huán)境中的哪些物質(zhì)，通過什么信號傳導途徑引起Lhx8 m</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　[1] 金國華,張新化,田美玲,等. 大鼠海馬內(nèi)移植神經(jīng)干細胞的存活和遷移[J]. 神經(jīng)解剖學雜志, 2003,

22、19(4):378-382.</p><p>　　[2] 張新化,金國華,秦建兵,等. 穹窿海馬傘切割側(cè)海馬對植入神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的影響[J]. 神經(jīng)解剖學雜志, 2004,20(4):360-364.</p><p>　　[3] 金國華,張新化,田美玲,等. 穹窿海馬傘切割側(cè)海馬提取液對神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的促進作用[J]. 解剖學報, 2004,40(2):141-145.&l

23、t;/p><p>　　[4] Zhao Y, Marin O, Hermesz E, et al. The LIM-homeobox gene Lhx8 is required for the development of many cholinergic neurons in the mouse forebrain[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2003 ,100(15):9005-90

24、10.</p><p>　　[5] Manabe T, Tatsumi K, Inoue M, et al. L3/Lhx8 is involved in the determination of cholinergic or GABAergic cell fate[J]. J Neurochem，2005，94(3): 723-730.</p><p>　　[6] 徐慧君. 神經(jīng)生物學[

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